杜氏利什曼原蟲amastin基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)

1、杜氏利什曼原蟲 amastin 基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)作者：李金福 , 陳建平 , 楊志偉 , 田玉, 馬瑩, 胡孝素【關(guān)鍵詞】 杜氏利什曼原蟲 ;, 無鞭毛體蛋白基因 ;, 體外表達(dá)Construction and expression of recombinant eucaryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania DonovaniAbstract AIM: To construct recombinant eukaryotic expression plasmid of amastin gene of Leis

2、hmania Donovani anddetectexpressionofthegeneinNIH3T3cells.METHODS: Amastin gene was amplified from nuclear DNA of Leishmania Donovani isolates and cloned into an eukaryotic expression vector pcDNA31(+). The recombinant plasmid was named pcDNA31amastin. NIH3T3 cell was transfected by pcDNA31amastin.

3、Transient and stable expression of amastin gene were detected by immunofluoresence and RTPCR. RESULTS: It was found that there was high green fluorescence on the cell membraneand inside the cell. It showed that NIH3T3 cell was transfected by pcDNA31amastin successfully. CONCLUSION: A recombinant euk

4、aryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania歡迎下載支持，謝謝！ Donovani was successfully constructed, and can be expressed stably in the NIH3T3 cells.KeywordsLeishmania Donovani; amastin gene; express in vitro 摘 要 目的 : 構(gòu)建杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蛋白 (amastin) 編碼基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒 pcDNA31amastin, 并研究其在 NIH3T3 細(xì)胞中的表達(dá)。方

5、法：提取杜氏利什曼原蟲基因組 DNA進(jìn)行PCRT增。 將擴(kuò)增的無鞭毛體蛋白基因片段導(dǎo)入質(zhì)粒pcDNA31(+)中，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒 pcDNA31amastin 以 pcDNA31amastin轉(zhuǎn)染 NIH3T3細(xì)胞， 采用免疫熒光染色法和RTPC分別鑒定pcDNA31amastin的瞬時(shí)表達(dá)和 穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)果 ： 在細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)均觀察到較強(qiáng)的綠色熒光 , 表明 pcDNA31amastin成功地轉(zhuǎn)入NIH3T3細(xì)胞，并在細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)獲得 短暫表達(dá)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，用PCF擴(kuò)增 出無鞭毛體蛋白基因 , 表明獲得了穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)論 ： 成功地構(gòu)建杜氏 利什曼

6、原蟲無鞭毛體蛋白基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒 , 并且該基因在 NIH3T3細(xì)胞中獲得了穩(wěn)定表達(dá)。 關(guān)鍵詞 杜氏利什曼原蟲 ; 無鞭毛體蛋白基因 ; 體外表達(dá) 杜氏利什曼原蟲是一種胞內(nèi)寄生原蟲 , 由媒介昆蟲白蛉傳播其引起的黑熱病致死率極高，WHO/TDR已將其列為6種重點(diǎn)防治的熱 帶病之一。因現(xiàn)有疫苗效果不夠理想 , 目前尚無可大規(guī)模用于臨床的 黑熱病預(yù)防接種疫苗。 因而, 尋找有效的、 新的黑熱病疫苗候選分子 已成為當(dāng)今黑熱病預(yù)防研究工作的重點(diǎn)。近年來 , 對(duì)無鞭毛體蛋白 (amastin) 的研究1, 2 使其有望成為一種黑熱病疫苗的候選分子。 本 研究根據(jù)GenBank中登錄的4種利什曼原蟲

7、無鞭毛體蛋白編碼基因的 序列 , 自行設(shè)計(jì)引物 , 克隆了杜氏利什曼原蟲的無鞭毛體蛋白編碼基 因，并將其導(dǎo)入質(zhì)粒 pcDNA31(+)中，構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒 pcDNA31amastin, 并在 NIH3T3 細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá) , 為進(jìn)一步構(gòu)建 黑熱病無鞭毛體蛋白基因疫苗奠定了基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材 料 杜 氏 利 什 曼 原 蟲 四 川 省 汶 川 縣 人 分 離 株(MHOM/CN/90/SC10H及NIH3T3細(xì)胞均由本室保存。限制性內(nèi)切酶 Bambi和Xho I為Fermentas公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增所用聚合酶 Premix Ex Taq 為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品

8、。膠回收試劑盒為 Bioer Tech no logy公司產(chǎn)品。質(zhì)粒小量提取試劑盒為 Omega公司產(chǎn)品。T4 DNA 連接酶為 NewEngland Labs 公司產(chǎn)品。兔抗杜氏利什曼原蟲血清由本 室自行制備 , FITC 標(biāo)記的羊抗兔抗體為北京成文免疫化學(xué)研究室產(chǎn) 品。轉(zhuǎn)染試劑KeygenTrans皿為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。 總RNA提取試劑盒及cDNA第 1鏈合成試劑盒均為上海生工生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。M199培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基及G418均為Gibco公司產(chǎn)品。1.2 方法蟲體基因組DNA的提取 將蟲株從液氮中取出，轉(zhuǎn)入 NNN培養(yǎng)基中于27C培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)入含150

9、mL/L小牛血清的M199 培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)蟲體總數(shù)達(dá)5X 109- 1X 1010時(shí)收集蟲體， 參照文獻(xiàn) 3 的方法略加修改提取蟲體基因組 DNA。1.2.2 PCR引物的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)Gen Ba nk中登錄的4種利 什曼原蟲無鞭毛體蛋白編碼基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物 , 在上游引物 P1的5端添加BamH I識(shí)別序列和保護(hù)序列，在下游引物P2的5 端添加 Xho I 識(shí)別序列和保護(hù)序列。 引物的合成由寶生物工程 （大連） 有 限 公 司 完 成 。 引 物 的 序 列 如 下 :P1:5 GGCGGATCCATGCTGTGCTCGTGCATCG線處為 BamH 酶切位點(diǎn)）； P2:

10、5 CGCCTCGAGCTACATTATAATCAGCAGCACCJ線處為 Xho I 酶切位點(diǎn)）。無鞭毛體蛋白基因的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)條件為94C預(yù)變 性3 min,然后94C變性30 s, 60 C退火40 s, 72 C延伸40 s,共 30個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)后于72C再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。124無鞭毛體蛋白基因的克隆 將上述PCF產(chǎn)物、質(zhì)粒載 體pcDNA31(+)分別以BamH I和Xho I雙酶切，經(jīng)膠回收試劑盒純化 酶切后的產(chǎn)物 , 并用 T4 DNA 連接酶將無鞭毛體蛋白基因片段與質(zhì)粒 pcDNA31(+)相連接。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化預(yù)先制備

11、的大腸桿菌DH5x感受態(tài)細(xì)胞 , 將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)基平皿上 , 于 37C培養(yǎng) 16 h。重組質(zhì)粒的PCF篩選與鑒定從上述LB平皿上，隨機(jī) 挑取數(shù)個(gè)菌落分別接種入含有氨芐青霉素的 LB 液體培養(yǎng)基的試管中 , 于37C劇烈振搖培養(yǎng)過夜。以P1、P2為引物，從各管中分別取12 卩L菌液直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，能 擴(kuò)增出無鞭毛體蛋白基因片段者即為陽性的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒的酶切鑒定 用質(zhì)粒小量提取試劑盒從經(jīng)PCF篩選、鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒克隆中提取重組質(zhì)粒DNA,并進(jìn)行 BamH I 和 Xho I 的雙酶切及 BamH I 的單酶切 ,

12、酶切產(chǎn)物經(jīng) 10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。無鞭毛體蛋白基因序列的測(cè)定 使用雙脫氧鏈終止法 全自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)PCF鑒定及酶切鑒定均正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè) 序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。128 以pcDNA31amastin轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前24 h,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 NIH3T3細(xì)胞（使用含100 mL/L小牛血 清、1 X 105 U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DME完全培養(yǎng)液培養(yǎng)） 用胰蛋白酶消化，按5X 105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞 生長(zhǎng)至70%左右匯合時(shí)用于轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為pcDNA31（+）對(duì)照組和pcDNA31amastin實(shí)驗(yàn)

13、組。先將5卩g質(zhì)粒DNAffl入到100卩L PBS中， 混勻后加入轉(zhuǎn)染試劑10卩L,混勻，室溫放置15 min。然后，在輕微 振搖培養(yǎng)板的同時(shí)將混合液逐滴加入孔中 , 以使混合液均勻分散。最 后將培養(yǎng)板放置于37C、50 mL/L C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。目的基因瞬時(shí)表達(dá)的免疫熒光法檢測(cè) 參照文獻(xiàn) 8 的 方法略加修改。在 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中制作細(xì)胞爬片 , 于轉(zhuǎn)染后 48 h 依次經(jīng)PBS清洗、40 g/L多聚甲醛固定30 min、PBS清洗、20 mL/L Triton X100處理15 min、PBS清洗及加封閉血清于 37C封閉15 min 后，加20卩L 1 : 200兔抗杜氏利什曼原

14、蟲血清（4C過夜，PBS清洗） 及1 : 100 FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體（37C孵育15 min, PBS清洗），加 緩沖甘油封片后 , 在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。 穩(wěn)定表達(dá)目 的基因細(xì)胞克隆的 G418篩選轉(zhuǎn)染48 h后，換用含300 mg/L G418 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞 , 每 2 d 更換 1 次培養(yǎng)液。當(dāng)空白對(duì)照孔中的 細(xì)胞完全死亡時(shí) , 換用含 150 mg/L G418 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) , 每 2 d 更換 1 次培養(yǎng)液 , 至穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞克隆出現(xiàn)時(shí) , 接種入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。目的基因穩(wěn)定表達(dá)的RTPC鑒定 經(jīng)G418篩選后存活 細(xì)胞生長(zhǎng)至80注右匯合時(shí)，采用

15、總RNA提取試劑盒提取其總RNA所 獲總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，再用前述引物進(jìn)行PCRT增，以鑒定其是否可 穩(wěn)定表達(dá)無鞭毛體蛋白基因。2 結(jié)果2.1無鞭毛體蛋白基因的PCRT增用PC肪法從杜氏利什曼 原蟲的基因組DNA中,擴(kuò)增出同預(yù)期大小一致、 大小約550 bp的DNA 片段（圖 1）。圖1無鞭毛體蛋白基因PCRT增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳（略）Fig 1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of amastin geneM:DNAmarker（DL2000）;1:Amastingenefragment;2:Negativecontrol.2.2重組質(zhì)

16、粒的PCF鑒定 對(duì)隨機(jī)挑取的LB平皿上的各菌落進(jìn)行PCRT增篩選鑒定，絕大部分?jǐn)U增出大小約550 bp的DNA片段； 而空質(zhì)粒對(duì)照則為陰性（圖 2）。圖2重組質(zhì)粒PCF產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析（略）Fig 2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product of recombinant plasmidM: DNAmarker（DL 2000）； 1: PCRproduct of pcDNA3.1（+）； 2: PCR product of pcDNA3.1amastin.2.3重組質(zhì)粒的酶切鑒定 用BamH I和Xho I對(duì)PCF鑒定正

17、確的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切 , 可見與空質(zhì)粒等大大小約 5400 bp 的片段 和約550bp目的片段；用BamH對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，可見大小約 5900 bp 的片段（圖 3）。圖 3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定（略）Fig 3 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmidM1:DNA marker(DL2000)； 1:pcDNA3.1(+)/BamH I； 2: pcDNA3.1amastin/BamH I; 3: pcDNA3.1amastin/BamH I+Xho I; M2: DNA marker(marke

18、r VI).2.4 目的基因表達(dá)的免疫熒光法檢測(cè) 在熒光顯微鏡下 , pcDNA3.1amastin轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有較強(qiáng)的 綠色熒光(圖 4A), 同一視野中的細(xì)胞在普通光下形態(tài)清晰 (圖 4B), 表明pcDNA3.1amastin已成功地轉(zhuǎn)入NIH3T3細(xì)胞，并在細(xì)胞膜和細(xì)胞 質(zhì)內(nèi)短暫表達(dá)；而空質(zhì)粒pcDNA31(+)轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞在熒光顯微 鏡下未顯示綠色熒光 (圖 4C), 同一視野中的細(xì)胞在普通光下形態(tài)也 清晰(圖 4D)。圖4重組質(zhì)粒pcDNA3.1amastin在NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)的免 疫熒光法檢測(cè)(略)Fig 4 Immunofluore

19、scence analysis of the expression ofrecomb inant plasmid pcDNA3.1amastin in NIH3T3 cells ( x 200)A: NIH3T3 cells transfected by pcDNA3.1amastin (under fluorescence microscope)； B: NIH3T3 cells transfected by pcDNA3.1amastin (under lightmicroscope)；C:NIH3T3cellstransfectedbypcDNA3.1(+)(underfluoresce

20、ncemicroscope)； D: NIH3T3 cells transfected by pcDNA3.1(+) (underlight microscope).2.5 pcDNA3.1amastin在NIH3T3細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的 RTPC鑒 定 經(jīng)G418篩選后，存活細(xì)胞的總RNA經(jīng)RTPCF可擴(kuò)增出無鞭毛體蛋 白基因；而空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞總RNA經(jīng)RTPC未 擴(kuò)增出任何產(chǎn)物(圖5),表明無鞭毛體蛋白基因在 NIH3T3細(xì)胞中獲 得穩(wěn)定表達(dá)。圖5 pcDNA3.1amastin在NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)的 RTPCF檢測(cè) (略)Fig 5 Detection

21、 of the expression of pcDNA3.1amastin in NIH3T3 by RTPCRM: DNAmarker(DL 2000)； 1: RTPCRproduct in N I H 3T3 cells transfected by pcDNA3.1amastin； 2: RTPCRproduct in NIH3T3cells transfected by pcDNA3.1(+)； 3: Positive control.3 討論杜氏利什曼原蟲隱性感染者或黑熱病患者康復(fù)后 , 體內(nèi)可產(chǎn) 生針對(duì)該原蟲的持久保護(hù)性免疫應(yīng)答 , 以防止再感染 , 說明利用免疫 預(yù)防接種防止杜

22、氏利什曼原蟲的感染是可行的。免疫預(yù)防的免疫原可 以來源于基因工程表達(dá)的蛋白或其亞單位 , 也可以是編碼該蛋白的基 因, 但選擇目的蛋白或其編碼基因作為免疫原則至關(guān)重要。 1994 年, Teixeira等1通過對(duì)錐蟲cDNA文庫(kù)的差異篩選，在國(guó)際上首次報(bào)道 并成功克隆了位于錐蟲蟲體表面的無鞭毛體蛋白基因。 2000 年, 成軍 等4 利用核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)檢索 , 發(fā)現(xiàn)與錐蟲無鞭毛體蛋白 基因同源的碩大利什曼原蟲無鞭毛體蛋白基因部分片段 , 之后在全球 首次成功地克隆了碩大利什曼原蟲的無鞭毛體蛋白基因。迄今已經(jīng)發(fā) 現(xiàn)無鞭毛體蛋白家族由 45 個(gè)成員所組成 , 所有成員都擁有一個(gè)高度 保守的

23、由 11 個(gè)氨基酸組成的胞外結(jié)構(gòu)域 , 并且主要表達(dá)在錐蟲和利 什曼原蟲的無鞭毛體時(shí)期，是一種期特異性表達(dá)蛋白5。Salotra等 的研究表明，在患黑熱病后皮膚利什曼?。≒KDL時(shí)無鞭毛體蛋白 的表達(dá)上調(diào) , 其在改變患者的臨床表現(xiàn)上可能起重要作用 , 以致影響 黑熱病的臨床治療效果。 Stober 等7 對(duì) 100 種新的碩大利什曼原蟲 的候選疫苗進(jìn)行了篩選 , 發(fā)現(xiàn)無鞭毛體蛋白是一種最有前途的保護(hù)性 抗原。加之由于無鞭毛體蛋白位于利什曼原蟲蟲體的表面 , 在利什曼 原蟲感染宿主后便有更多與宿主免疫系統(tǒng)接觸的機(jī)會(huì) , 因而有望成為 抗利什曼原蟲感染的候選疫苗。本研究中克隆了利什曼原蟲中對(duì)人生

24、命威脅最大的杜氏利什曼原蟲的無鞭毛體蛋白基因（GenBank中的登錄號(hào)為DQ864502）,成功 地構(gòu)建了其真核表達(dá)重組質(zhì)粒 pcDNA31amastir。以其轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì) 胞后, 用免疫熒光法檢測(cè)顯示 , 在 NIH3T3 細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有綠色熒光。經(jīng)G418篩選后存活細(xì)胞的總RNA經(jīng)RTPC擴(kuò)增出無鞭 毛體蛋白基因 , 表明無鞭毛體蛋白基因可在真核細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá) , 為 黑熱病無鞭毛體蛋白基因疫苗的研制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。參考文獻(xiàn) :1 Teixeira SM, Russell DG, Kirchhoff CY, et al.Differentially expressed g

25、ene family encoding“ amastin ” , asurface protein of Trypanosomacruzi amastigotesJ. J Biol Chem, 1994, 269(32): 20509-20516.2 成 軍, 鐘彥偉 , 劉 妍, 等. 利什曼原蟲無鞭毛體蛋白 的基因克隆化與序列分析 J. 中華傳染病雜志 , 2001, 19(1): 27-31.3 Smyth AJ, Ghosh A, Hassan MQ, et al. Rapid and sensitive detection of leishmania kinetoplast DNA from spleen and blood samples