第十五章___甾體激素類藥物的分析

1、藥物分析藥物分析Xiangnan University第十五章第十五章: : 甾體激素類藥物甾體激素類藥物的分析的分析基基 本本 要要 求求1掌握本類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、特征官能團(tuán)與分析方法的關(guān)系。2掌握高效液相色譜法、紫外分光光度法、四氮唑比色法、異煙肼比色法、Kober反應(yīng)比色法等含量測(cè)定方法。3熟悉本類藥物常用的鑒別試驗(yàn)和特殊雜質(zhì)的檢查方法。甾體激素類藥物的分析甾體激素類藥物的分析甾體激素類藥物甾體激素類藥物環(huán)戊烷并多氫菲母環(huán)戊烷并多氫菲母核的激素類藥物核的激素類藥物Steriod Hormones甾體激素類藥物的分析甾體激素類藥物的分析1.甾體激素是在研究甾體激素是在研究哺哺乳動(dòng)物乳動(dòng)物內(nèi)

2、分泌系統(tǒng)內(nèi)分泌系統(tǒng)時(shí)發(fā)時(shí)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性物質(zhì)現(xiàn)的內(nèi)源性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)史史2.1932年年至至1939年年間，從間，從腺體腺體中獲得中獲得雌酮雌酮(1932)、雌二醇雌二醇(1932)、睪酮睪酮(1935年年)及及皮質(zhì)皮質(zhì)酮酮(1939)等的純品等的純品結(jié)晶結(jié)晶。 3.隨后，發(fā)明用隨后，發(fā)明用薯蕷皂甙薯蕷皂甙(Diosgenin)為原料進(jìn)行為原料進(jìn)行半合成半合成生產(chǎn)甾體藥物，使生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)生產(chǎn)甾體藥物，使生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大，成本降低大，成本降低 4.發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)激素腎上腺皮質(zhì)激素治療治療風(fēng)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎濕性關(guān)節(jié)炎及其在及其在免疫調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)上上的重要價(jià)值，使甾體藥物成為的重要價(jià)值，使甾體藥物成為醫(yī)院中不可

3、缺少的藥物醫(yī)院中不可缺少的藥物 5.甾體口服甾體口服避孕藥避孕藥的研究成功，的研究成功，使人類生育控制達(dá)到了新水平使人類生育控制達(dá)到了新水平 12341234567891011121314151617ABCD母體母體結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)18181918192120母體衍母體衍生結(jié)構(gòu)生結(jié)構(gòu)甾體激素甾體激素腎上腺皮質(zhì)激素腎上腺皮質(zhì)激素性激素性激素雄性激素及蛋雄性激素及蛋白同化激素白同化激素孕激素孕激素雌激素雌激素分類分類藥理作用藥理作用一、腎上腺皮質(zhì)激素OHOOHOCH2OHHHH311172021氫化可的松(hydrocortisone)OHOOHOHFHOCH3OHCH3醋酸地塞米松(dexamethas

4、one acetate)16-甲基21-酯化17-羥基9-氟3-酮1,2-雙鍵11-羥基20-酮OCH3OHCH3HHOPFHHCH3OHOOONaONaOCH3CH3HOHHHODesoxycortisone Acetate)CH3OOCH3OHHCH3HFHHOOOH3CCH3CH3OO本類藥物結(jié)構(gòu)特征本類藥物結(jié)構(gòu)特征A環(huán)環(huán)4-3-酮基酮基,為為共軛體系共軛體系,在波長(zhǎng)在波長(zhǎng)240nm附近有紫附近有紫外吸收外吸收,部分藥物部分藥物在在C1-C2之間有雙之間有雙鍵鍵,也有紫外吸收也有紫外吸收OCH3OHHCH3HFHHOOOH3CCH3CH3OO本類藥物結(jié)構(gòu)特征本類藥物結(jié)構(gòu)特征C17位上為位

5、上為-醇酮醇酮基基,具有還原性具有還原性.多數(shù)多數(shù)藥物有藥物有C17-羥基羥基,部分藥物部分藥物-醇羥基醇羥基與酸成酯與酸成酯.OCH3OHHCH3HFHHOOOH3CCH3CH3OO本類藥物結(jié)構(gòu)特征本類藥物結(jié)構(gòu)特征部分藥物的部分藥物的C6或或C9位由鹵素取代位由鹵素取代,呈相呈相應(yīng)的鹵化物反應(yīng)應(yīng)的鹵化物反應(yīng)OCH3OHHCH3HFHHOOOH3CCH3CH3OO本類藥物結(jié)構(gòu)特征本類藥物結(jié)構(gòu)特征部分藥物部分藥物C11位上有位上有羥基或酮基取代羥基或酮基取代二、雄性激素及蛋白同化激素CH3HHCH3HOHCH3O甲睪酮(methyltestosterone)OOHHHHOCH3丙酸睪酮(test

6、osterone propionate)OOHHHHO苯丙酸諾龍(nandrolone phenylpropionate)1717- -羥基羥基作用更強(qiáng)作用更強(qiáng)吸收減緩吸收減緩CH3HHCH3HOHCH3O甲睪酮(methyltestosterone)A環(huán)環(huán)4-3-酮基酮基C17位上為羥基位上為羥基,部部分藥物的羥基被酯化分藥物的羥基被酯化雄性激素上的母核為雄性激素上的母核為19個(gè)個(gè)碳原子碳原子,蛋白同化激素在蛋白同化激素在C10位上一般無(wú)角甲基位上一般無(wú)角甲基,母母核只有核只有18個(gè)碳原子個(gè)碳原子二、雄性激素及蛋白同化激素本類藥物結(jié)構(gòu)特征本類藥物結(jié)構(gòu)特征三、孕激素三、孕激素COHHHCH3O

7、黃體酮(progesterone)CH3OCH3OCH3OHHHO醋酸甲地孕酮(megestrol acetate )乙酰氧基，乙酰氧基，具口服活性具口服活性C17C17位位- -羥孕酮類羥孕酮類OHCH3HOHHH炔諾酮(norethisterone)H3C左炔諾孕酮左炔諾孕酮三、孕激素三、孕激素C19C19位位去甲睪丸酮類去甲睪丸酮類三、孕激素COHHHCH3O黃體酮(progesterone)A環(huán)環(huán)4-3-酮基酮基C17位上有甲酮基位上有甲酮基或乙炔基或乙炔基.多數(shù)在多數(shù)在C17位上有位上有羥基羥基,部分藥物的部分藥物的羥基被酯化羥基被酯化四、雌性激素HOHHHOHCH3Hstradio

8、lHOHHCH3HthyinylestradiolCOHCH四、雌性激素HOHHHOHCH3Hstradiol有些藥物在有些藥物在C17位位上有乙炔基上有乙炔基,構(gòu)成構(gòu)成19-去甲孕甾烷母核去甲孕甾烷母核A環(huán)為苯環(huán)環(huán)為苯環(huán),C3位位上有酚羥基上有酚羥基,有的有的藥物藥物C3位上的酚位上的酚羥基成酯羥基成酯C17位上有羥基有位上有羥基有些藥物些藥物C17位羥基位羥基成酯成酯.種類主要活性基團(tuán)4-3-酮C17-醇酮基4-3-酮C17-羥基4-3-酮C17-甲酮基C17-乙炔基A環(huán)為3-OH苯環(huán) UV、與重氮苯磺酸鹽反應(yīng)C17-乙炔基C17-羥基與硝酸銀反應(yīng)可成酯可成酯UV、與羰基試劑反應(yīng)與亞硝基鐵

9、氰化鈉反應(yīng)與硝酸銀反應(yīng)UV、與羰基試劑反應(yīng)性質(zhì)還原性UV、與羰基試劑反應(yīng)腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌激素總結(jié)如下總結(jié)如下u 物理常數(shù)的測(cè)定物理常數(shù)的測(cè)定u 化學(xué)鑒別法化學(xué)鑒別法u 制備衍生物測(cè)定熔點(diǎn)制備衍生物測(cè)定熔點(diǎn)u UVu IRu TLCu HPLC理化性質(zhì)與鑒別試驗(yàn)理化性質(zhì)與鑒別試驗(yàn)一、物理常數(shù)的測(cè)定1.1.熔點(diǎn)熔點(diǎn)HO+COClKOHCOO+KCl+H2O炔雌醇炔雌醇m.p.201OCCH3O+2HONH2NCHOCH3NOH+2H2O黃體酮黃體酮雙肟m.p.238苯丙酸諾龍苯丙酸諾龍縮氨基脲縮氨基脲m.p.178185分解分解OCOCH2CH2OC6H5+NH2CNH

10、NH2OHClNCH2NOH+H2O+HAcOCOCH2CH2N+H2OOHO+CH3CH2COOHOCOCH2CH3OKOH丙酸睪丸素丙酸睪丸素m.p.150156二、化學(xué)鑒別法2.比旋度比旋度3.吸收系數(shù)吸收系數(shù)與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)官能團(tuán)的反應(yīng)官能團(tuán)的反應(yīng)1.與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)甾體激素類藥物硫酸、磷酸、高氯酸、鹽酸硫酸、磷酸、高氯酸、鹽酸呈色與硫酸顯色反應(yīng)與硫酸顯色反應(yīng) 顯顯 色色 熒光熒光 加水稀釋加水稀釋潑尼松龍潑尼松龍 深紅深紅 絮狀絮狀灰灰潑尼松潑尼松 橙橙 黃黃藍(lán)綠藍(lán)綠炔雌醚炔雌醚 橙紅橙紅 黃綠黃綠 紅色紅色 炔雌醇炔雌醇 橙紅橙紅 黃綠黃綠 絮狀絮狀

11、玫紅玫紅醋酸可的松醋酸可的松 黃或微黃或微 褪色并澄褪色并澄 帶橙帶橙 清清2.官能團(tuán)的反應(yīng)官能團(tuán)的反應(yīng) C C1717-醇酮基醇酮基還原性還原性A. 呈色反應(yīng)呈色反應(yīng)C17-醇酮基四氮唑鹽OH-呈色B. 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)C17-醇酮基氨制硝酸銀銀鏡反應(yīng)C17-醇酮基堿性酒石酸銅Cu2OOHOOHOCH2OHHHH C C3 3酮基和酮基和C C2020酮基酮基甾酮類甾酮類2,4-2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼呈色呈色異煙肼、硫酸苯肼異煙肼、硫酸苯肼OOHNCONHNH2HClCONHNOHN異煙腙（黃色）異煙腙（黃色）睪酮睪酮C ON H NCC H3N H N OCNN異煙雙腙（黃色）異煙雙

12、腙（黃色）OCCH3O2NCONHNH2HCl黃體酮黃體酮 甲酮基甲酮基或或活潑亞甲基活潑亞甲基亞硝基鐵氰化鈉間二硝基酚/芳香醛呈色COCH3O NOCNFe OHH2O2+-4Fe5CNNOCHCOO藍(lán)紫色藍(lán)紫色黃體酮黃體酮專屬鑒別反應(yīng)專屬鑒別反應(yīng)黃體酮黃體酮藍(lán)紫色藍(lán)紫色亞硝基鐵亞硝基鐵 氰化鈉氰化鈉其他甾體其他甾體淡橙色或淡橙色或不顯色不顯色有機(jī)氟有機(jī)氟F有機(jī)破壞有機(jī)破壞有機(jī)氯有機(jī)氯Cl有機(jī)有機(jī)鹵素鹵素茜素氟藍(lán)茜素氟藍(lán) 硝酸亞鈰硝酸亞鈰硝酸硝酸硝酸銀硝酸銀AgCl 呈藍(lán)紫色呈藍(lán)紫色 乙炔基乙炔基RCCHAgNO3RCCAgOHCCHHO炔雌醇炔雌醇3AgNOOHCCAgHO白白 酯基酯基

13、酚羥基酚羥基雌激素類重氮苯磺酸紅色偶氮染料-3-3-酮、酮、苯環(huán)苯環(huán)、其他共軛結(jié)構(gòu)、其他共軛結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)依據(jù)結(jié)構(gòu)依據(jù)240nm240nm左右左右280nm左右左右三、UV結(jié)構(gòu)特征：酚羥基結(jié)構(gòu)特征：酚羥基、C C17 17 OHOH C C17 17 乙炔基乙炔基炔雌醇炔雌醇OHCCHHO四、IR1505cm-1OH 3505cm-13300cm-1CH CC 1590cm-13610cm-1OH 酚羥基酚羥基醇羥基醇羥基1615cm-1苯環(huán)的骨苯環(huán)的骨架振動(dòng)架振動(dòng)黃體酮黃體酮COHHHCH3O結(jié)構(gòu)特征：結(jié)構(gòu)特征：-3-3-酮、酮、C C1717- -酮基酮基四、IR1700cm-1 C=O20位酮

14、基位酮基1665cm-13位酮基位酮基1615cm-1870cm-1 C-H雙鍵雙鍵五、五、TLCTLC法法 主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別 方法：對(duì)照品法 要求供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn)相同。 主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別（如：醋酸曲安奈德軟膏、醋酸氟輕松軟膏） 方法：對(duì)照品法 要求在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品峰的tR與對(duì)照品峰的tR一致。六、六、HPLCHPLC法法一、有關(guān)物質(zhì)的檢查檢查方法（具有一定分離能力） TLC法（高低濃度對(duì)比法） HPLC法（類似高低濃度對(duì)比法）氫化可的松氫化可的松中中其他甾體其他甾體檢查檢查對(duì)照品對(duì)照品60g/ml供試品供

15、試品3.0mg/mlvCHCl3-MeOH(9:1) 溶劑溶劑v硅膠GF254v二氯甲烷-乙醚-甲醇-水v 385 :60 : 15 : 2385 :60 : 15 : 2v展開(kāi)后晾干v105干燥10minv堿性四氮唑藍(lán)顯色（一）TLC判定方法：v 規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目v 規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色對(duì)照溶液0.02mg/ml供試液1 mg/ml（二）HPLC黃體酮中有關(guān)物質(zhì)檢查供試品溶液的雜質(zhì)峰數(shù)不得超過(guò)1個(gè)，其面積不得大于對(duì)照液的主峰面積的3/4二、硒的檢查來(lái)源 合成中用合成中用二氧化硒二氧化硒(SeO(SeO2 2) )脫氫脫氫46SeSe鹽酸羥胺氧瓶燃燒有機(jī)藥物苯苯并并苯苯硒硒二二唑唑二二氨氨基基萘萘

16、5 , 43,24 Se .pHnmA 環(huán)環(huán)己己烷烷三、溶劑殘留甲醇和丙酮()0.3%0.5%四、游離磷酸鹽檢查四、游離磷酸鹽檢查 OnHMoOPHPOHPOMoOH24103433424還原還原鉬藍(lán)鉬藍(lán)鉬酸銨鉬酸銨磷鉬酸磷鉬酸740nm，UV-Visu HPLCu UVu 比色法u 非水溶液滴定法四氮唑比色法異煙肼比色法柯柏反應(yīng)比色法一、HPLC對(duì)照液供試液己烯雌酚黃體酮二、UV-Vis化合物結(jié)構(gòu)max(nm)腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素孕激素雌激素2804-3-酮240醋酸地塞米松苯環(huán)苯環(huán)三、比色法 腎上腺皮質(zhì)激素類有有色色甲甲瓚瓚四四氮氮唑唑鹽鹽醇醇酮酮基基 17COH -還原還原CC6H5N

17、NNNC6H5C6H5+Cl2e(H)CC6H5NNNNC6H5C6H5H2,3,5-Triphenyltatrazolium chloride TTC(Red tatrazoline RT)氯化三苯四氮唑三苯甲(Formazan)深紅色 max 480490nm（一）四氮唑比色法（一）四氮唑比色法 N+ClOCH3N+ClOCH3NCNC6H5NC6H5NCNC6H5NC6H5NCNC6H5NHC6H5NCNC6H5NC6H5OCH3NN+ClOCH3NCNC6H5NHC6H5NCNC6H5C6H5OCH3NNOCH3NH2e(H)2e(H)藍(lán)四氮唑藍(lán)四氮唑Blue tetrazoline

18、BTBT-單甲BT-雙甲藍(lán)色藍(lán)色 max 525nm氫化可的松軟膏的含量測(cè)定氫化可的松軟膏的含量測(cè)定 精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各1ml，分別置干燥具塞試管中，各精密加無(wú)水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液1ml，搖勻，各再精密加氫氧化四甲基銨試液1ml，搖勻，在25的暗處放置40min45min，在485nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得 影響因素基團(tuán)基團(tuán)溶劑與水分溶劑與水分堿堿空氣中氧與光線空氣中氧與光線溫度與時(shí)間溫度與時(shí)間（1）基團(tuán)對(duì)反應(yīng)速度的影響C11= O C17OHC21OH C21-酯酯（2） 溶劑、水分的影響含水量含水量5%含水含水10%A10%含水含水30%幾無(wú)反應(yīng)幾無(wú)反

19、應(yīng) 無(wú)水乙醇(無(wú)醛)（一）四氮唑比色法（一）四氮唑比色法（3） O2與光線的影響 反應(yīng)及其產(chǎn)物對(duì)光敏感，避光，隔絕空氣（4）堿的種類及加入順序反應(yīng)應(yīng)在強(qiáng)堿性（反應(yīng)應(yīng)在強(qiáng)堿性（pH13.75）條件下進(jìn)行）條件下進(jìn)行以以氫氧化四甲基銨氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳的結(jié)果最佳堿堿試試液液四四氮氮唑唑鹽鹽皮皮質(zhì)質(zhì)激激素素溶溶液液（5） 溫度與時(shí)間t甲甲分解分解%（一）四氮唑比色法（一）四氮唑比色法室溫（室溫（2525）反應(yīng)）反應(yīng)404045 min45 min( (二二) )異煙肼法異煙肼法(Isonicotinic acid hydrazide)+ONCONHNH2NCONNHINH4-3-酮Isonic

20、otinic acid HydrazideAh160異煙肼甲醇溶解對(duì)照液供試液腎上腺皮質(zhì)激素、 雄性激素和蛋白同化激素、孕激素討論討論（1 1）反應(yīng)速度）反應(yīng)速度C3= O C17= O 、 C20= O ； C11= O 不反應(yīng)不反應(yīng)專屬性強(qiáng)（2 2）溶劑的選擇）溶劑的選擇異煙肼鹽酸鹽異煙肼鹽酸鹽甲醇、乙醇甲醇、乙醇無(wú)水（3 3）水分、）水分、O O2 2與光線的影響與光線的影響含水量含水量腙水解腙水解A%具塞容器，不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時(shí)具塞容器，不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時(shí) O2與光線與光線無(wú)影響無(wú)影響4-3-酮甲醇對(duì)試劑的穩(wěn)定性好、甲醇對(duì)試劑的穩(wěn)定性好、呈色強(qiáng)度較無(wú)水乙醇中呈色強(qiáng)度較無(wú)水乙

21、醇中高、但對(duì)植物油的溶解高、但對(duì)植物油的溶解度小度小(4)酸、異煙肼的量鹽酸 : 異煙肼 = 2 : 1酸度 異煙肼酸度 A(5)溫度t ( (三三) ) Kober反應(yīng)比色法反應(yīng)比色法第一步呈黃色max465nm共熱雌激素H2SO4 乙醇H2O or 稀H2SO4稀釋再加熱第二步桃紅色max515nmOHCH3O SOHCH3CH3O SOHCH3CH3O第二步反應(yīng)515465450 500 550 nmAKober 反應(yīng)吸收光譜第一步反應(yīng)采用本法測(cè)定炔雌醇片及復(fù)方炔諾酮片、復(fù)方炔諾孕酮采用本法測(cè)定炔雌醇片及復(fù)方炔諾酮片、復(fù)方炔諾孕酮滴丸、復(fù)方左炔諾孕酮片中的炔雌醇的含量滴丸、復(fù)方左炔諾孕酮片中的炔雌醇的含量加入鐵酚試劑加入鐵酚試劑(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚苯酚* 鐵鹽的作用 加快黃色產(chǎn)物的形成、轉(zhuǎn)化 加強(qiáng)紅色產(chǎn)物的穩(wěn)定性* 酚的作用 加快紅色產(chǎn)物的形成 消除反應(yīng)產(chǎn)生的熒光Iron-phenol Reagent第五節(jié)第五節(jié) 生物樣本中甾體激素的分析生物樣本中甾體激素的分析GC-MS:尿樣尿樣SPE萃取萃取衍生化衍生化GC/MS分析分析HPLC-MS:血清血清 HPLC/MS分析分析練習(xí)與思考練習(xí)與思考AA型題型題 1. 1.