中藥夏枯草對甲狀腺癌細胞NIS基因表達及攝碘率的影響

1、中藥夏枯草對甲狀腺癌細胞NIS基因表達及攝碘率的影響                     作者：張王峰, 付強, 趙華棟, 徐海峰，周潤鎖, 袁夢暉, 周飛華, 南菁     【摘要】  目的： 探討中藥夏枯草對甲狀腺癌細胞株K1鈉/碘同向轉(zhuǎn)運體(NIS)基因表達及攝碘率的影響，為夏枯草輔助放射性碘治療甲狀腺癌提供依據(jù). 方法： 分別以不同濃度

2、(0, 20, 50, 100, 150, 200 g/L)的夏枯草處理體外培養(yǎng)的甲狀腺癌細胞株(K1)，48 h后利用半定量RT?PCR檢測細胞NIS mRNA表達，?布剖?儀檢測細胞攝碘能力. 結(jié)果： 夏枯草濃度在0100 g/L范圍內(nèi)，細胞NIS基因表達及攝碘能力隨夏枯草濃度的增加而增加(P<0.05). 當夏枯草濃度達150200 g/L時，增加后濃度與100 g/L濃度相比差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05). 結(jié)論： 夏枯草可上調(diào)甲狀腺癌K1細胞NIS基因表達，增強其攝碘率，而且這種作用在一定濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴性. 【關(guān)鍵詞】  夏枯草；甲狀腺腫瘤；腫瘤細胞；

3、RT?PCR；碘同向轉(zhuǎn)運體；攝碘率【Abstract】 AIM: To investigate the effect of traditional Chinese medicine Prunella vulgaris on the expression of sodium iodide symporter (NIS) gene and radioiodide uptake in thyroid cancer cell line(K1), so as to evaluate the significance of traditional Chinese medicine Prunella vul

4、garis in the treatment of thyroid cancer with radioiodide. METHODS：The thyroid cancer cell line(K1) was treated with traditional Chinese medicine Prunella vulgaris at concentrations of 0, 20, 50, 100, 150, 200 g/L for 48 h. The expression level of NIS mRNA of K1 was determined by RT?PCR and its radi

5、oiodide concentration activity was measured by ?counter. RESULTS： Traditional Chinese medicine Prunella vulgaris at the concentration between 0 and 100 g/L increased the expression of NIS gene and the radioiodide uptake of K1. There was no significant difference between 150-200 g/L and 100 g/L (P<

6、;0.05).CONCLUSION： Traditional Chinese medicine Prunella vulgaris could increase the expression of NIS gene and the activity of radioiodide concentration of thyroid cancer cell line(K1)in a dose?dependent mannerTraditional Chinese medicine Prunella vulgaris  may play a role in the therapy of th

7、yroid cancer.【Keywords】 Prunella vulgaris；thyroid neoplasms tumor cells；RT?PCR；NIS；radioiodide uptake0  引言    中藥夏枯草治療甲狀腺腫瘤有悠久歷史，目前多種專利報道的抗癌中成藥的主要成分也是夏枯草1-3. 臨床治療中，甲狀腺癌對化療藥物不敏感，而放射性碘治療分化型甲狀腺癌療效確切. 如何提高甲狀腺癌細胞的攝碘率是目前研究的熱點. 鈉/碘同向轉(zhuǎn)運體 (Sodium/Iodide Symporter，NIS)基因被認為與甲狀腺細胞對碘的攝取有密切關(guān)系.

8、 本研究以人甲狀腺癌細胞系K1為研究對象，觀察了夏枯草對甲狀腺腫瘤細胞鈉/碘同向轉(zhuǎn)運體NIS基因表達及攝碘率的影響，從而探討夏枯草能否增加甲狀腺癌對碘的攝取以起到增加放射性碘對甲狀腺癌的療效.1  材料和方法11 材料  NU?2500型CO2培養(yǎng)箱（美國HUAIRE公司）；GU?20低溫高速冷凍離心機（江蘇太倉醫(yī)療儀器廠）；SW?CJ?IF凈化工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；人甲狀腺乳頭狀癌細胞系K1（歐洲細胞培養(yǎng)中心），于飽和濕度、37，50 mL/L CO2的條件下進行傳代培養(yǎng)；Na125I（成都中核高通同位素有限公司生產(chǎn)，放射化學純度99.7%無載體 p

9、H 8.0）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物材料工程有限公司）；Trizol（Gibco公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）；PCR酶為 rTaKaRa(寶泰克公司)；PCR反應引物（北京奧科生物技術(shù)公司）. NIS上游引物序列為5?tggttaagggaccggaagacatc?3，下游引物序列為5?agttgcctactgcaatctacaagg?3，產(chǎn)物片段為342 bp. GAPDH（3?擦姿岣視腿亞餉福?，上游引物序列為5?AGGTCCACCACTGACACGTT?3，下游引物序列為5?GCCTCAAGATCATCAGCAAT?3，產(chǎn)物片段為31

10、0 bp. 夏枯草配制：40 g夏枯草加水400 mL，煮沸30 min并過濾除渣，熬制濃縮液定容至40 mL，濾液濃縮濃度為1 g/mL，經(jīng)120 30 min高壓滅菌后，用直徑為22 m的微孔濾膜正壓過濾，使用時用DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需的不同濃度梯度.1.2   方法 1.2.1  細胞培養(yǎng)  取對數(shù)生長期的細胞以1×108個/L密度接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后懸浮細胞貼壁，然后換以新的培養(yǎng)液加入不同濃度夏枯草（0，20，50，100，150，200 g/L）. 作用48 h后收集細胞進行相應指標的檢測.12.2  RT

11、?PCR檢測 NIS mRNA的表達  取1×108個/L細胞，加1 mL Trizol裂解液于培養(yǎng)瓶中，用細胞刮勺將細胞充分刮下，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管， 室溫5 min，加200 mL氯仿，混勻，室溫5  min，4離心，8000 r/min，15 min，將上清轉(zhuǎn)入新管，加5 mL異丙醇，混勻，室溫10 min，4離心，8000 r/min，10 min. 去上清，加1 mL 750 mL/L 乙醇(DEPC 水配制)，4離心，8000 r/min，5 min. 去上清，沉淀物加去離子水溶解，讀取A260nm測量RNA濃度. 每個樣品取1 g RNA進行反轉(zhuǎn)

12、錄，于20 L反應體系中加入oligo dT(500 mg/ L)1 L，細胞總RNA 1 g，dNTP（25 mmol/L）4 L，加水至12  L， 65， 5 min. 冰浴2 min，短時離心后加入5×反應緩沖液4 L， 0.1 mol/ L  DTT 2 L， RNase OUT 重組核糖核酸酶抑制劑(40 U/L) 1 L， 混勻， 42， 2 min，加反轉(zhuǎn)錄酶1 L (200 U/L)，42， 50 min， 70，15 min后終止反應. PCR 擴增在25 L體系中加入10×反應緩沖液2.5 L，dNTP (2.5 mmol/ L）4

13、 L，模板(cDNA) 2 L， 上游引物與下游引物各2 L (10 mol/ L)， PCR Taq 酶1 U， 加水至25 L. PCR 條件：以GAPDH基因表達產(chǎn)物為內(nèi)參照進行半定量RT?PCR，NIS循環(huán)參數(shù)為94預變性5 min，繼以94變性30 s，56退火30 s，72延伸30 s，35個循環(huán)后72延伸10 min. GADPH循環(huán)參數(shù)為94預變性5 min，繼以94變性30 s，55退火30 s，72延伸30 s，35個循環(huán)后72延伸10 min. 各取10 L PCR反應液在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB染色后照相. Kodak  Digital Scie

14、nce ID軟件系統(tǒng)掃描，測定光密度值并計算NISGAPDH光密度比值. 其結(jié)果為3次重復實驗結(jié)果.123  ?布剖?儀檢測細胞攝碘能力  夏枯草作用48 h后收集細胞于小試管，調(diào)整細胞數(shù)，使每管的細胞個數(shù)為1×106個. 離心棄上清，用PBS清洗兩次. 向每個試管加入l mL含125I的HBSS溶液 (含37 kBq 125I)10，將試管于37放置1 h，離心去除上清液，用HBSS洗兩次. 于?布剖?儀檢測細胞的攝碘水平.     統(tǒng)計學處理  采用SPSS100統(tǒng)計軟件. 數(shù)據(jù)以x±s表示. 計量資料比較采用

15、t檢驗和方差分析處理. P<005為差異有統(tǒng)計學意義.2  結(jié)果21  RT?PCR檢測NIS mRNA  經(jīng)不同濃度的夏枯草處理48 h后，K1細胞NIS mRNA水平上調(diào)(圖1). 當夏枯草濃度在0150 g/L范圍內(nèi)，基因表達隨夏枯草濃度的增加而增加(P<0.05). 當夏枯草濃度達200 g/L時，NIS mRNA的增加與前一濃度相比差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05).  A：NIS的表達；B：GAPDH的表達. M：marker.圖1  RT?PCR分析NIS基因在不同濃度夏枯草作用下的表達（略）22  ?布

16、剖?儀檢測細胞攝碘能力  20 g/L的夏枯草作用后細胞攝碘能力便出現(xiàn)增強，隨著夏枯草濃度的增加細胞攝碘能力逐漸增強(P<0.05)，但150 g/L濃度組與100 g/L濃度組相比增加不明顯(P>0.05，圖2).圖2  夏枯草對甲狀腺癌細胞攝碘能力的影響（略）3  討論    研究報道單味藥夏枯草經(jīng)水煎醇提法制成的夏枯草注射液對胃癌、大腸癌的體內(nèi)外實驗表明夏枯草具有一定的抗腫瘤作用，可以改善病情，提高生存質(zhì)量4-5.鈉/碘同向轉(zhuǎn)運體(NIS)是存在于甲狀腺濾泡細胞基底側(cè)細胞膜上的一種糖化膜蛋白，即所謂的“碘泵”，其功能

17、主要是將血液中的碘攝取入甲狀腺濾泡細胞內(nèi)，以便合成甲狀腺激素. 1996年，Dai等6首先從FPTL?5細胞的cDNA文庫中克隆出鼠NIS基因，同年，Smanik等7用針對鼠NIS cDNA序列的引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄?簿酆廈噶捶從?擴增出人類NIS(hNIS)的細胞cDNA片段，隨后從人甲狀腺細胞cDNA文庫中克隆出hNIS. hNIS基因位于19號染色體上，整個編碼區(qū)由15個外顯子及14個內(nèi)含子構(gòu)成，其開放閱讀框架為1929個核甘酸，編碼643個氨基酸殘基7. 研究發(fā)現(xiàn)8，在不同病理狀態(tài)下，甲狀腺組織NIS基因表達存在明顯差異. 自主功能性腺瘤、Graves病和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者NIS的表達增加.

18、 而在甲狀腺癌組織中，NIS的表達一般均低于正常甲狀腺組織. Franco等9利用RT?PCR方法比較了正常甲狀腺組織與甲狀腺癌組織中NIS基因的表達，結(jié)果顯示，在甲狀腺癌組織中，NIS基因的表達普遍低于正常甲狀腺組織. 甲狀腺癌組織NIS基因的降低導致其攝碘能力的下降.     文獻報道中藥能逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的惡性表型，中藥及其配伍對多種腫瘤細胞均具有一定的誘導分化作用10. 本課題結(jié)果顯示經(jīng)一定濃度的夏枯草刺激后，甲狀腺癌細胞系K1 NIS基因表達水平及攝碘能力較對照組明顯提高. 因此，我們認為K1細胞NIS基因表達、攝碘能力的提高是夏枯草誘導細胞分化的結(jié)果. &

19、#160;   甲狀腺癌分化程度越高，攝碘能力越強. 由于乳頭狀甲狀腺癌細胞具有一定的攝碘能力，因此利用放射性碘可進一步去除術(shù)后的殘余灶及轉(zhuǎn)移灶，從而大大改善甲狀腺癌患者的預后. 但甲狀腺癌攝碘能力低于正常甲狀腺組織限制了放射性碘治療的臨床應用. 本實驗結(jié)果顯示，甲狀腺癌細胞株K1經(jīng)夏枯草處理后，NIS基因表達上調(diào)、細胞的攝碘能力增強，這一實驗結(jié)果為放射性碘治療甲狀腺癌提供了新的思路. 若能夠通過應用夏枯草的誘導分化作用，誘導NIS基因的表達，促進甲狀腺癌細胞向成熟階段分化，恢復或提高其攝碘能力，然后再結(jié)合放射性碘的聯(lián)合治療模式，則可能獲得滿意的臨床效果. 但本實驗是建立在

20、體外細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上得出的結(jié)論，缺少體內(nèi)研究結(jié)果的證實. 其次，夏枯草誘導分化的機制尚不清楚，仍然處于實驗研究階段，缺乏進一步的臨床研究. 今后應當進一步加強夏枯草誘導分化的體內(nèi)的研究與臨床觀察，發(fā)掘中藥夏枯草在腫瘤的治療中作用.【參考文獻】  1 齊 杰，齊迎新一種抗癌藥物及其制備方法P中國發(fā)明專利申請公開說明書：CN 1380089 CN 021173052，20022 蔡緒旺一種抗癌中藥膠囊制劑P中國發(fā)明專利申請公開說明書：CN 1742866，20063 李光淳一種抗癌藥及制備方法P中國發(fā)明專利申請公開說明書：CN 1733275，20064 王 琨，董惠芳，章曉鷹，等. 夏枯草對SGC?7901細胞的影響J上海醫(yī)學檢驗雜志，2000，15(5)：305-306. 5 王文海，周榮耀，倪愛娣，等. 夏枯草注