兔纖維環(huán)細胞和骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)的初步研究(一)

1、兔纖維環(huán)細胞和骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)的初步研究(一)    作者：張福勇，吳小濤，王運濤，鮑軍平，朱磊，邱勻峰【摘要】 目的：初步探討骨髓間充質干細胞（BMMSCs）與纖維環(huán)（AF）細胞的共培養(yǎng)對細胞增殖及主要細胞外基質的影響，進一步確定BMMSCs移植對椎間盤退變的預防和治療作用。方法：分別培養(yǎng)兔的BMMSCs與AF細胞，將兩種細胞按11的比例混勻，利用離心管培養(yǎng)技術培養(yǎng)3周后取材，大體觀察并行HE染色；使用熒光染料Hoechst33258檢測細胞增殖；通過實時熒光PCR對型膠原、蛋白多糖含量進行測定。結果：在體外培養(yǎng)3周后，細胞團體積達到最大，涂片染

2、色顯示共培養(yǎng)組細胞致密，細胞增殖較對照組明顯，實時熒光PCR檢測結果顯示型膠原及蛋白多糖mRNA表達增強。結論：在離心管內三維培養(yǎng)條件下，BMMSCs與AF細胞共培養(yǎng)能夠促進增殖，增加型膠原和蛋白多糖的含量。 【關鍵詞】 骨髓間充質干細胞； 纖維環(huán)細胞； 生物醫(yī)學工程； 細胞培養(yǎng)； 兔下腰痛是一種常見的骨科疾患，發(fā)病率高，75%80的人在其一生中的某個階段都會受到下腰痛的困擾。椎間盤退變是導致下腰痛最常見的原因，臨床常用的手術及保守治療雖然能夠取得一定的治療效果，但并非針對椎間盤退變本身，目前的治療方法并不能夠阻止椎間盤的退變1 。椎間盤退變的合理解決方法就是對退變的椎間盤進行生物學修復。椎間

3、盤有外層的纖維環(huán)（AF）、內部的髓核及上下終板構成。在椎間盤退變防治研究中,AF的生物學作用越來越受到人們的重視,維持和修復AF的完整性有著重要的意義2 。本研究觀察骨髓間充質干細胞（BMMSCs）與AF細胞共培養(yǎng)后是否可以促進細胞增殖及蛋白多糖和型膠原的表達，達到阻止和抑制椎間盤退變的目的。1 材料與方法1.1 實驗儀器與材料實驗儀器包括721分光光度計(上海市儀器廠)，高速冷凍離心機(德國Heraeus公司)，倒置熒光相差顯微鏡(德國Zeiss公司)，5%CO2細胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，數碼照相機(日本Canon公司)；實驗材料有木瓜蛋白酶(E.Merck公司)，100%胎牛血

4、清(杭州四季青生物公司)，胰蛋白酶(美國 Sigma公司)，臺盼藍試劑(美國Sigma公司)，塑料離心管(Corning公司)，LG-DMEM培養(yǎng)基、型膠原酶、Hoechst33258和Calf Thymus DNA等試劑（Gibco公司）;新西蘭大白兔由江蘇省農業(yè)科學院提供。實時熒光PCR委托上海拓科生物技術有限公司檢測。1.2 實驗步驟1.2.1 取材 BMMSCs的分離 取1月齡新西蘭大白兔30只,雌雄不拘,體重0.50.6 kg，1%戊巴比妥鈉按2 ml·kg-1 的劑量施以全身麻醉，無菌操作下切取兔的股骨,兩端剪斷,用PBS液沖洗,收集細胞,離心后用15的胎牛

5、血清DMEM培養(yǎng)液制備成細胞懸液,然后于37 、5CO2、100飽和濕度條件下培養(yǎng)。5 d后第1次換液，以后每隔3 d換液1次，培養(yǎng)至第3代3。 AF細胞的分離 取1月齡新西蘭大白兔54只，雌雄不拘，體重0.50.6 kg，同上法麻醉后無菌條件下取出兔的脊柱，剔除周圍軟組織，取出椎間盤，放入含有PBS的培養(yǎng)皿內，用眼科剪去除終板及髓核組織，將AF的最外層及最內層去除，留取中間部分（圖1），用PBS液沖洗3遍后，用眼科剪將組織剪成1 mm3大小，移入含有20 ml型膠原酶的培養(yǎng)皿內消化68 h，120目過濾器過濾后PBS液洗滌3遍，用15的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液制備成細胞懸液,置3

6、7 、5CO2、100飽和濕度條件下培養(yǎng)。5 d后第1次換液，以后每隔3 d換液1次，培養(yǎng)3周后待用4。圖1 終板及髓核被清除后的AFFig 1 AF after nucleus pulposus and endplate were removed 共培養(yǎng)模型的建立及分組 單層培養(yǎng)的細胞經胰酶消化后，按照每管含5×105 BMMSCs、AF細胞或11的比例混合細胞，將細胞懸液移入15 ml塑料離心管內，再加入DMEM培養(yǎng)液至5 ml，其中含10的胎牛血清、100 U·ml-1青霉素、100 g·ml-1鏈霉素，pH 7.4，以20×g的離心

7、力低速離心5 min形成微球，置于37 、5CO2、100飽和濕度下培養(yǎng)，由此形成3個觀察組，即BMMSCs組、AF細胞組和共培養(yǎng)組。5 d后第1次換液，以后每隔3 d進行半量換液，培養(yǎng)至第21天對各項指標進行檢測4。1.2.2 觀察指標 組織學檢查 取離心管內培養(yǎng)的細胞團，大體觀察并涂片、固定，然后行HE染色，觀察細胞形態(tài)和組織結構。 DNA含量測定 培養(yǎng)3周后，組織塊用20 U·ml-1的木瓜蛋白酶消化過夜，采用Hoechst33258熒光法測定各離心管內細胞的DNA含量。20 l標本中加1 g·ml-1 的 Hoechst33258溶液2

8、ml，以牛胸腺DNA作為標準品繪制標準曲線，比較測定結果。 型膠原及蛋白多糖的PCR檢測 細胞培養(yǎng)3周后,以Trizol試劑裂解細胞。實時熒光PCR法檢測mRNA表達：應用Cyber Green法，實時熒光PCR在MJ OPTICON 2定量PCR檢測儀上進行，實驗結果用OPTICON Monitor Analysis軟件分析。所用引物序列均由上海生工生物工程公司合成。型膠原蛋白正義鏈GACCCCATGCAGTACATG,反義鏈 GACGGTCTTGCCCCACTT；蛋白聚糖正義鏈GAGGTCGTGAAAGGTGT,反義鏈GTGTGGATGGGGTACCTGAC。1.3 統(tǒng)計學處

9、理結果采用SAS 8.1統(tǒng)計學軟件分析，數據以x-±s表示。多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結 果2.1 光鏡及大體觀察AF細胞貼壁速度相當緩慢,5 d后開始有部分細胞貼壁，15 d后細胞貼壁數目不再增多，初始細胞呈圓形，后呈多角形、梭形或不規(guī)則形狀,輪廓清楚,細胞核呈圓形，見圖2。 細胞懸液經離心后，在離心管底部形成小的細胞團，直徑約1 mm。3 d后細胞團的體積逐漸增大，BMMSCs組細胞團松散易碎，共培養(yǎng)組細胞團緊密不易吹散，AF細胞組居中。至第3周時，細胞團體積達到最大，共培養(yǎng)組細胞團可達到6 mm，BMMSCs組細胞團未見明顯

10、增大，AF細胞組細胞團體積略小于共培養(yǎng)組。2.2 細胞形態(tài)學觀察至第3周時，HE染色觀察細胞形態(tài)，AF細胞呈圓形或不規(guī)則形狀，排列欠規(guī)整；BMMSCs呈橢圓形，排列稀疏欠規(guī)整；共培養(yǎng)組細胞呈圓形或不規(guī)則形狀，細胞排列緊密，見圖3。2.3 DNA含量測定在細胞接種后第1周，細胞DNA含量變化不明顯；第2周時DNA含量共培養(yǎng)組迅速增加，AF細胞組稍增加，BMMSCs組減少；第3周時趨于穩(wěn)定。共培養(yǎng)組DNA含量隨時間延長而逐步增加，至第21天時明顯高于BMMSCs及AF細胞組，差異有統(tǒng)計學意義（均P0.05,表 1）。 表1 培養(yǎng)不同時間細胞DNA含量測定結果2.4 型膠原及蛋白多糖mRNA的表達體

11、外培養(yǎng)3周的細胞經實時熒光PCR檢測顯示，共培養(yǎng)組細胞的型膠原及蛋白多糖基因表達明顯高于AF細胞組及BMMSCs組（均P0.01，表2），且AF細胞組的表達量明顯高于BMMSCs組（均P0.05）。表2 型膠原及蛋白多糖的mRNA表達(3 討 論椎間盤隨著年齡的增加以及各種因素的影響而逐漸發(fā)生退行性變化。椎間盤退變的病理改變之一為AF的應力損傷,導致AF微斷裂,使髓核突出。在椎間盤退變的早期，具有修復能力的AF細胞上調蛋白多糖和其它間質中的大分子，內部AF蛋白多糖含量的增加可在一定程度上彌補成人早期髓核蛋白多糖的下降5。退變晚期的椎間盤內細胞數量減少及功能受損，使得AF的自身修復能力下降，難以

12、維持和修復自身的退變。此外椎間盤內細胞密度低，來源受限，使得通過簡單的椎間盤細胞移植來修復AF存在困難。目前主要根據椎間盤退變的程度來決定修復策略，在退變晚期，椎間盤細胞代謝功能嚴重受損，已經不能夠回應任何的生物學刺激，必須借助生物工程學以達到修復的目的。三維培養(yǎng)能夠穩(wěn)定椎間盤細胞的形狀和結構，是維持細胞形態(tài)和表型所必需的。離心管培養(yǎng)是一種新而簡單的培養(yǎng)椎間盤細胞的技術。這種三維培養(yǎng)只需要簡單的離心，細胞團內相鄰細胞間形成三維接觸，有利于細胞外基質的合成6。分泌的細胞外基質使得細胞緊密地結合在一起，形成細胞與細胞間的接觸，模擬椎間盤內的環(huán)境，有利于細胞團內的細胞維持天然的表型。細胞團在最初的2

13、周內顯著長大，3周后趨于穩(wěn)定，達到最大尺寸。細胞團體積的增大是由于細胞外基質的合成及細胞的增殖，之后體積不再增大與通往細胞團中心的營養(yǎng)通道下降有關。BMMSCs具有以下特點：取材方便且對機體無害；由它誘導而來的組織在進行移植時不存在組織配型及免疫排斥的問題；它可以向多種組織類型分化，在體外可大量培養(yǎng)擴增；轉入外源性基因后不影響其特性3。因此，BMMSCs成為骨組織工程理想的種子細胞，在治療椎間盤退化方面取得了實質性的進展。本研究我們測試BMMSCs是否能夠調整AF細胞蛋白多糖和型膠原的合成，是否可用于治療或延緩椎間盤退變。髓核細胞在椎間盤退變過程中逐漸消失，因此在體內BMMSCs主要作用于AF

14、細胞，而且獲得大量有活性的髓核細胞相當困難，從而AF細胞成為修復椎間盤退變的靶向細胞4 。椎間盤細胞與BMMSCs間及其細胞與細胞外基質間的相互作用機制尚不清楚，可能與細胞間縫隙連接及細胞因子等因素有關。Gruber等7證實了AF細胞間存在著縫隙連接，它的存在可以促進細胞的增殖及細胞外基質的分泌。Yamamoto等8證實了共培養(yǎng)模型中TGF-1、IGF- 1、EGF、PDGF等含量明顯增高，這些生長因子主要來自于BMMSCs，它們被證明可以促進椎間盤細胞的生長。本研究中的離心管培養(yǎng)模型有利于BMMSCs與AF細胞間細胞因子的傳遞，有利于縫隙連接的形成，有利于細胞的增殖及細胞外基質的分泌，證明了

15、體外共培養(yǎng)此兩種細胞存在著可能性，且細胞團內的細胞維持著分泌細胞外蛋白多糖和型膠原的能力。本研究為進一步探索BMMSCs治療椎間盤退變的可能性提供了證據?！緟⒖嘉墨I】1HOWARD S A,EUGENE J T,MASUDA K.Biological repair of intervertebral discJ.Spine,2003,28(15):S86- S92.2PETER J R.Biology of intervertebral disc aging and degeneration involvement of the extracellular matrixJ.Spine,2004

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