見血封喉內(nèi)生真菌的分離鑒定及抑菌活性研究

1、第40卷第6期2009年6月中草藥ChineseTraditionalandHerbalDrugs植物學報,1997,17(1):4925519李昂,葛頌1植物保護遺傳學研究進展J1生物多樣性,2002,10(1):61271110肖猛1瀕危植物桃兒七的遺傳多樣性研究D1成都:四川大學,2006195511馬紹賓,胡志浩1桃兒七分布格局與生態(tài)適應(yīng)的初步研究J1武漢植物學研究,1996,14(1):47254112田英,郭帥,彭勵,等1寧夏六盤山瀕危植物桃兒七的生存現(xiàn)狀及保護對策研究J1農(nóng)業(yè)科學研究,2006,27(2):822851見血封喉內(nèi)生真菌的分離鑒定及抑菌活性研究戴文君1,張秀環(huán)1,黃

2、貴修2,戴好富1,梅文莉1環(huán)境與植物保護研究所,海南儋州571737)摘要:目的分離和鑒定見血封喉Antiaristoxicaria。方法以金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、耐甲氧西林金黃色球2taphylococcusaureus(MRSA)和白色念珠菌Candidaalbicans作為指示菌,。結(jié)果從見血封喉根的韌皮部中分離出6株內(nèi)生真菌,(TrichotheciumLK1exFr1)、枝頂孢霉屬(AcremoniumLK1exFr1)(RFr1)。其中內(nèi)生真菌J6的發(fā)酵上清液對MR2SA有抑菌活性,抑菌圈直徑為,內(nèi)生真菌J6對MRSA有明顯的抑菌活性,。關(guān)鍵詞:中圖

3、分類號文獻標識碼:A文章編號:025322670(2009)06209552033(11中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所,海南?？?71101;21中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院Isolation,identification,andantimicrobialactivityofendophyticfungifromAntiaristoxicariaDAIWen2jun1,ZHANGXiu2huan1,HUANGGui2xiu2,DAIHao2fu1,MEIWen2li1(11InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofT

4、ropicalAgriculturalSciences,Haikou571101,China;21EnvironmentandPlantProtectionInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Danzhou571737,China)Abstract:ObjectiveToisolateandidentifyendophyticfungifromthephloemintherootofAntiaristoxicariaanddetecttheantimicrobialactivityofthesestrains1Metho

5、dsStaphylococcusaureus,methicil2lin2resistantStaphylococcusaureus(MRSA),andCandidaalbicanswereselectedasindicators1Theanti2microbialactivitiesofthefermentationfiltrateofendophyticfungiweretestedbycylinderplatemethod1ResultsSixendophyticfungiwereisolatedfromthephloemintherootofA1toxicaria.Thesestrain

6、sweremorphologicallyidentifiedtogenusofTrichotheciumLK.exFr.,AcremoniumLK1exFr1andRhi2zoctoniaDC1exFr1ThefermentationfiltrateofendophyticfungusJ6showedtheantimicrobialactivitya2gainstMRSA1Thediameterofinhibitionzonewas18mm1ConclusionItsthefirstreportabouttheen2dophyticfungifromA1toxicaria1Endophytic

7、fungusJ6exhibitsstrongantimicrobialactivityagainstMR2SA,itsactivecomponentsareofworthtofurtherstudy1Keywords:Antiaristoxicaria(Pers1)Lesch1;endophyticfungi;antimicrobialactivity植物內(nèi)生真菌是指生長于植物的根、莖、葉等組織和器官內(nèi)的一類真菌,是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成成分,在進化過程中與植物宿主建立了和諧的共生關(guān)系,其次生代謝產(chǎn)物十分豐富,是新化合3收稿日期:2008209218基金項目:973計劃前期研究專項(200

8、7CB116306);海南省自然科學基金資助項目(30608);海南省自然科學基金指導性項目(80671),女,湖北武漢人,碩士研究生,現(xiàn)主要從事微生物學研究。作者簡介:戴文君(1984Tel:(0898)66968572E2mail:daishu198420033通訊作者梅文莉Tel:(0898)66988061E2mail:meiwenliyahoo1com1cn956第40卷第6期2009年6月中草藥ChineseTraditionalandHerbalDrugs物、新藥源的潛在資源1。Strobel等2認為,那些生長于獨特生態(tài)環(huán)境的植物、有著民族藥用歷史的植物、樹齡較長或者當?shù)靥赜械闹?/p>

9、物往往具有特殊的內(nèi)生真菌,這些內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物往往很特別,可用于新藥開發(fā)。近年來,我國藥用植物內(nèi)生真菌及其活性成分的研究成為了藥物開發(fā)的熱點3,4。見血封喉Antiaristoxicaria(Pers1)Le2sch1為?？埔娧夂韺僦参?別名箭毒木、剪刀樹、股份有限公司);ZD8802D搖床(太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司);HHB11360S普通培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)。2方法211內(nèi)生真菌的分離與純化7:將剛采集的新鮮見血封喉的板狀根韌皮部用自來水洗凈泥土及灰塵,瀝干水分。再將材料放進經(jīng)過紫外線消毒的超凈工作臺內(nèi),切割成110cm×210cm小段,按常規(guī)無菌操作進行表面

10、消費處理:75%乙醇浸泡3min無菌水沖洗3遍011%升汞浸泡8min無菌水沖洗3遍。,在無0的小塊,放置于新鮮,每個平板放置4塊,28恒7d。待切口邊緣長出真菌菌絲,及時轉(zhuǎn)PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),采用菌絲頂端純化法逐步純化。同時,以消毒后不做切割的材料作為空白對照,同樣條件下觀察是否有菌長出,結(jié)果對照材料周圍無任何菌長出,證明表面消費徹底。212內(nèi)生真菌的鑒定:采用真菌學插片培養(yǎng)方法,對分離獲得的見血封喉內(nèi)生真菌進行顯微形態(tài)特征(菌絲、孢子形態(tài)等)的觀察、分類鑒定。分類檢索參照文獻報道8。213內(nèi)生真菌的發(fā)酵上清液制備:將分離得到的菌株,切取黃豆粒大小的菌絲塊,接種于PDB培養(yǎng)基中。1L三角瓶裝

11、400mL培養(yǎng)液,室溫,164r/min振蕩培養(yǎng)7d,同時以純培養(yǎng)基作空白對照。無菌條件下取發(fā)酵液15mL于離心管中,12000r/min離心30min后取上清液,用012m微孔濾膜濾過除菌,-20保存?zhèn)溆谩?14抑菌活性測定:采用杯碟法測定樣品抑菌活性。金黃色葡萄球菌和MRSA采用NA培養(yǎng)基,白色念珠菌采用YPD培養(yǎng)基。將金黃色葡萄球菌、MRSA和白色念珠菌分別制成一定濃度的菌懸液(1×1051×107cfu/mL),用棉簽將其均勻涂布在供試無菌培養(yǎng)皿中,制成含菌平板,然后在每個平板放入3個牛津杯,分別取樣品200L加入其內(nèi),同時以發(fā)酵純培養(yǎng)基作陰性對照。金黃色葡萄球菌和

12、MRSA在37下恒溫培養(yǎng),白色念珠菌在28下恒溫培養(yǎng)。24h后觀察結(jié)果,測量并記錄抑菌圈直徑。每個樣品做3個重復(fù),以抑菌圈直徑的平均值為試驗結(jié)果。3結(jié)果與分析311內(nèi)生真菌的分離結(jié)果:本實驗共分離獲得6株加布,在我國已被列為三級瀕危珍稀植物。見血封喉屬植物有4個種3個變種,主要分布于東南亞。我國僅產(chǎn)1種,即見血封喉,分布于海南、廣東、廣西等地。其鮮樹汁乳白色,有劇毒,入藥用于催吐、泄瀉、強心,還可用作麻醉劑;種子也有毒,入藥解熱止瀉,用于治療痢疾5,6。目前,對見血封喉內(nèi)生真菌的研究國內(nèi)外尚未見報道。1材料111供試材料:部分的板狀根韌皮部。植物材料于2007年3月采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶植

13、物園,由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所王祝年研究員鑒定,植物標本和菌株保存在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所。112培養(yǎng)基:PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基):馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,定容至1L,pH值自然,121滅菌20min,第一次分離時在培養(yǎng)基中加鏈霉素(50U/mL)抑制細菌生長。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB):馬鈴薯200g,葡萄糖20g,定容至1L,pH值自然,121滅菌20min。NA培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂):牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,定容至1L,pH714716,121滅菌30min;YPD培養(yǎng)基(酵母粉胨葡萄糖瓊脂):葡萄糖20

14、g,胰蛋白胨20g,酵母粉10g,定容至1L,pH710,121滅菌30min。113指示菌:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methi2cillin2resistantStaphylococcusaureus,MRSA)ATCC9551由英國HeriotWatt大學GrantJBur2gess博士提供;金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC51650和白色念珠菌Candidaalbi2cansATCC10231均購于海南省藥品檢驗所。114儀器:SW40潔凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);HVE50滅菌鍋(今日儀器第40卷第6期2009年6月中草藥ChineseT

15、raditionalandHerbalDrugs957內(nèi)生真菌(J1J6),經(jīng)顯微形態(tài)觀察,初步鑒定分別為聚端孢霉屬、枝頂孢霉屬和絲核菌屬(表1),其顯微形態(tài)特征見圖1。表1見血封喉根韌皮部內(nèi)生真菌的種群組成Table1DistributionofendophyticfungiisolatedfromphloeminrootofA1toxicaria綱目科屬菌株數(shù)目321編號J3,J4,J6J1,J2J5半知菌類從梗孢目從梗孢科聚端孢霉屬枝頂孢霉屬無孢菌群絲核菌屬圖1nhibitionofJ6onMRSA,。由于本試驗主要針對絲狀真菌,則未對其進行分離。抑菌活性試驗結(jié)果表明內(nèi)生真菌J6的發(fā)酵上

16、清液對MRSA有明顯的抑制作用。J6為聚端孢霉屬真菌,有報道10顯示該屬中有的種作為菌寄生真菌,能有效地抑制病原菌的擴展和危害,甚至殺死病原菌。目前,本課題組正在對內(nèi)生真菌J6的抑菌活性成分進行研究。致謝:本研究在內(nèi)生真菌的分類鑒定方面得到了中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所邢曉科副研究員的大力支持和幫助!參考文獻:圖1見血封喉內(nèi)生真菌顯微形態(tài)特征Fig11MicroscopicalmorphologicalcharactersofendophyticfungifromA1toxicaria1鄒文欣,譚仁祥1植物內(nèi)生真菌研究進展J1植物學報,2001,43(9):881289212StrobelG,

17、DaisyB1BioprospectingformicrobialendophytesandtheirnaturalproductsJ1MicrobiolMolBiolRev,2003,67:491250213秦盛,邢珂,吳少華,等13種仙人掌植物內(nèi)生真菌抑456789312內(nèi)生真菌的抑菌活性:采用杯碟法對所分離到的見血封喉內(nèi)生真菌的發(fā)酵上清液進行了3種人體病原菌的抑菌活性試驗,結(jié)果表明內(nèi)生真菌J6的發(fā)酵上清液對MRSA有明顯的抑制作用,抑菌圈直徑為18mm(圖2)。4討論本實驗首次從見血封喉的板狀根韌皮部中分離獲得6株內(nèi)生真菌,經(jīng)初步鑒定,分別為聚端孢霉屬、枝頂孢霉屬和絲核菌屬,此次分離獲得的內(nèi)生真菌種類和數(shù)量均較少。已有報道指出內(nèi)生真菌之間存在占位效應(yīng),一種優(yōu)勢種進入植物內(nèi)部,建立共生關(guān)系,往往影響其他菌的進入9。本實驗在分離見血封喉內(nèi)生真菌時,曾發(fā)現(xiàn)消毒完全的組織塊周圍有大量的酵母菌長出,由此推測,酵母菌大量存在于10菌活性的研究J1中草藥,2006,37(6):91729211曾松榮,徐倩雯,葉保童,等1虎杖內(nèi)生真菌的分離及產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的篩選J1菌物研究,2005,3(2):24