第11章 DNA文庫的構(gòu)建和目標(biāo)基因的篩選

1、第十一章第十一章 DNA文庫的構(gòu)建和文庫的構(gòu)建和目標(biāo)基因的篩選目標(biāo)基因的篩選第一節(jié)第一節(jié) 基因組基因組DNADNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建第二節(jié)第二節(jié) cDNAcDNA基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建第三節(jié)第三節(jié) 基因克隆的篩選策略基因克隆的篩選策略第四節(jié)第四節(jié) DNADNA文庫的保存文庫的保存 基因庫基因庫(gene pool)：特定生物體全基因組的集合特定生物體全基因組的集合(天然存在天然存在) 基因文庫基因文庫(gene library)：從特定生物個體中分離的全部基因，從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在這些基因以克隆的形式存在(人工構(gòu)建人工構(gòu)建)。根據(jù)構(gòu)建方法的不。根據(jù)構(gòu)

2、建方法的不同，基因文庫分為：同，基因文庫分為：基因組文庫：材料來自染色體基因組文庫：材料來自染色體DNA，含有全部基因組序列。，含有全部基因組序列。任何器官、組織、細胞、任何發(fā)育時期以及在任何環(huán)境下，基任何器官、組織、細胞、任何發(fā)育時期以及在任何環(huán)境下，基因組因組DNADNA是衡定的，所以用該生物的任何材料均可構(gòu)建基因是衡定的，所以用該生物的任何材料均可構(gòu)建基因組組DNADNA文庫且具有一致性。文庫且具有一致性。cDNA文庫：材料來自文庫：材料來自mRNAmRNA，含有全部蛋白編碼基因的，含有全部蛋白編碼基因的cDNAcDNA，無，無啟動子、終止子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等，序列信息量遠小啟動子、

3、終止子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等，序列信息量遠小于基因組文庫。于基因組文庫。在高度分化的生物體中，不同器官、組織、細胞、不同發(fā)育時在高度分化的生物體中，不同器官、組織、細胞、不同發(fā)育時期以及對不同環(huán)境的應(yīng)答中，期以及對不同環(huán)境的應(yīng)答中，mRNAmRNA種類和豐度不同，即表達種類和豐度不同，即表達譜不同，因此同種生物體的譜不同，因此同種生物體的cDNAcDNA文庫隨表達譜變化而變化，文庫隨表達譜變化而變化，用什么材料構(gòu)建什么樣的用什么材料構(gòu)建什么樣的cDNAcDNA文庫依研究目標(biāo)而定。文庫依研究目標(biāo)而定。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程3第一節(jié)第一節(jié) 基因組基因組DNADNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建一、

4、基因組一、基因組DNA文庫的類型和發(fā)展文庫的類型和發(fā)展1、質(zhì)粒文庫：、質(zhì)粒文庫：容納片段小于容納片段小于15kb，以菌落的形式保存和篩選，以菌落的形式保存和篩選，一般用于對大片段文庫的亞克隆，用于鳥槍法測序等。一般用于對大片段文庫的亞克隆，用于鳥槍法測序等。2、噬菌體文庫：、噬菌體文庫：一般用一般用載體，插入型容納片段小于載體，插入型容納片段小于7kb，適，適合于構(gòu)建合于構(gòu)建cDNA文庫，置換型容納文庫，置換型容納9-25kb，適合于構(gòu)建亞克，適合于構(gòu)建亞克隆文庫或直接構(gòu)建基因組文庫。隆文庫或直接構(gòu)建基因組文庫。3、粘粒文庫：、粘粒文庫：一般用于直接構(gòu)建基因組文庫，最長插入片段一般用于直接構(gòu)建

5、基因組文庫，最長插入片段比比文庫略長，達文庫略長，達45kb左右。左右。4、人工染色體文庫：、人工染色體文庫：有有細菌人工染色體細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)、酵母人工染色體、酵母人工染色體(yeast artificial chromosome, YAC)、P1人工染色體人工染色體(P1 artificial chromosome, PAC)等文庫，最大插入片段分別為等文庫，最大插入片段分別為300kb、1000kb和和300kb，是大片段文庫，主要用于基因組測序和，是大片段文庫，主要用于基因組測序和圖譜構(gòu)建。圖譜構(gòu)建。西南大學(xué) 生

6、物技術(shù)專業(yè) 基因工程45、亞基因組文庫：、亞基因組文庫：文庫的對象只是基因組的一部分，可用染文庫的對象只是基因組的一部分，可用染色體顯微切割、色體顯微切割、PFGC特定片段回收、特定特定片段回收、特定YAC富集等方法富集等方法而產(chǎn)生，用于針對特定目標(biāo)基因?qū)Υ笃挝膸斓纳钊胙芯?。而產(chǎn)生，用于針對特定目標(biāo)基因?qū)Υ笃挝膸斓纳钊胙芯俊?、基因組文庫的發(fā)展：略、基因組文庫的發(fā)展：略二、文庫的代表性和隨機性二、文庫的代表性和隨機性代表性代表性意味著文庫要有意味著文庫要有完備性，完備性，是指在構(gòu)建的基因文庫中任一是指在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)基因存在的概率，它與基因文

7、庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)之間的關(guān)系可用下式表示：系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )。其中：其中：P P = = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?，任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?，f f = = 克隆克隆片段的平均大小片段的平均大小 / / 生物基因組的大小生物基因組的大小 。 例：人的單倍體例：人的單倍體DNA總長為總長為3.2 x 109 bp，假如文庫中克，假如文庫中克隆片段的平均大小為隆片段的平均大小為15 kb，則構(gòu)建一個完備性為，則構(gòu)建一個完備性為0.9的的基因基因文庫至少需要文庫至少需要45萬個克?。欢?dāng)完備性提高到萬個克

8、隆；而當(dāng)完備性提高到0.9999時，基時，基因文庫至少需要因文庫至少需要180萬個克隆萬個克隆。隨機性隨機性既表示構(gòu)建文庫時要從基因組既表示構(gòu)建文庫時要從基因組DNA獲得隨機斷裂的片段，獲得隨機斷裂的片段，也表示構(gòu)建好的文庫中所有基因要有相等的篩選概率。也表示構(gòu)建好的文庫中所有基因要有相等的篩選概率?；蛭膸斓馁|(zhì)量標(biāo)準基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準 除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件下列條件： 1 1、重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力； 2 2、載體的裝載量最好大于基因的長度，避

9、免基因被分隔克隆載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆 3 3、克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利于克克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利于克隆排序和染色全步查；隆排序和染色全步查； 4 4、克隆片段易于從載體分子上完整卸下進行亞克隆；克隆片段易于從載體分子上完整卸下進行亞克隆； 5、重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增和篩選，文庫繁殖后失真度小。重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增和篩選，文庫繁殖后失真度小。 1、基因組、基因組DNA的制備的制備為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，用于基因用于基因組組文庫構(gòu)建的文庫構(gòu)建的DNA在分

10、離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。裂。制備的制備的DNA分子量越大分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和片段的比率就越低，重組率和完備性也就完備性也就越高越高。用。用常規(guī)方法常規(guī)方法制備的染色體制備的染色體DNA的長度一般在的長度一般在100 kb左右左右。AAAA如果先將細胞固定在如果先將細胞固定在低融點凝低融點凝膠膠中，然后置入含有中，然后置入含有SDS、蛋白酶蛋白酶K、RNase的緩沖液的緩沖液中浸泡，可獲得中浸泡，可獲得1000 kb大大小的小的DNA片段片段三、基因組三、基因

11、組DNA文庫的構(gòu)建流程文庫的構(gòu)建流程 超聲波處理超聲波處理后的后的DNA片段呈片段呈平頭末端平頭末端，需加裝人工接頭，需加裝人工接頭 部分酶切法部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：，如：Sau3AI或或MboI等，這樣等，這樣DNA酶解片段的大小可控。酶解片段的大小可控。2、基因組、基因組DNA的切割的切割 用于基因組用于基因組文庫構(gòu)建的文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用片段的切割一般采用超超聲波處理聲波處理和和限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶部分酶切部分酶切兩種方法，其目的是：兩種方法，其目的是： 第一，保證第一，保證DNA片段之間存在部分重疊

12、區(qū)；片段之間存在部分重疊區(qū)； 第二，保證第二，保證DNA片段大小均一。片段大小均一。 連接前，上述處理的連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以提高文庫質(zhì)量。進行分級分離，以提高文庫質(zhì)量。3、載體和受體的選擇與制備、載體和受體的選擇與制備出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組基因組文庫文庫構(gòu)建的構(gòu)建的載體通常選載體通常選裝載量較大的裝載量較大的l l-DNA或柯斯質(zhì)粒；對于大型基因組或柯斯質(zhì)粒；對于大型基因組(如動植物如動植物和和人類人類)需使用需使用YAC或或BAC載體。載體。由于絕大多數(shù)真核生物的由于絕大多數(shù)真核生物的

13、mRNA小于小于10 kb，因此用于，因此用于cDNA文文庫庫構(gòu)構(gòu)建的載體通常選質(zhì)?；虿迦胄徒ǖ妮d體通常選質(zhì)?；虿迦胄蚻 l載體載體。幾種載體的最大裝載量：幾種載體的最大裝載量：質(zhì)粒質(zhì)粒 15 kb，-DNA 25 kb，考斯，考斯質(zhì)粒質(zhì)粒 45 kb，BAC 300 kb，YAC 1000 kb。 用于基因用于基因文庫構(gòu)文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌，建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌，根據(jù)載體不同，需要對受體制備感受態(tài)或進行合適的培養(yǎng)。根據(jù)載體不同，需要對受體制備感受態(tài)或進行合適的培養(yǎng)。載體制備中的注意事項：載體制備中的注意事項：1）載體本身要完整）載體本身要完整2）載體

14、去磷酸化要徹底）載體去磷酸化要徹底3）載體純度要高）載體純度要高西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程94、連接重組、包裝、轉(zhuǎn)化、連接重組、包裝、轉(zhuǎn)化/染染連接連接：將制備好的基因組：將制備好的基因組DNA片段與載體片段與載體DNA混合，在混合，在T4 DNA連接酶酶的作用下進行連接，形成重組載體。連接酶酶的作用下進行連接，形成重組載體?；蚧駾NA和載體和載體DNA片段要足夠純，雜質(zhì)少；片段要足夠純，雜質(zhì)少；連接時基因連接時基因DNA片段與載體片段的摩爾比很重要，根據(jù)情況片段與載體片段的摩爾比很重要，根據(jù)情況采用載體驅(qū)動或基因驅(qū)動策略；采用載體驅(qū)動或基因驅(qū)動策略；連接酶容易失活，操作條件很重要，

15、連接酶容易失活，操作條件很重要，16連接一至數(shù)小時。連接一至數(shù)小時。質(zhì)粒載體等的連接產(chǎn)物可以直接轉(zhuǎn)化宿主。質(zhì)粒載體等的連接產(chǎn)物可以直接轉(zhuǎn)化宿主。包裝：包裝：基因片段如果與基因片段如果與載體重組，則重組載體重組，則重組需要包裝進入特需要包裝進入特別制作的外殼蛋白中別制作的外殼蛋白中(包裝蛋白要妥善保存包裝蛋白要妥善保存)，然后用于感染，然后用于感染大腸桿菌，產(chǎn)生噬菌斑。大腸桿菌，產(chǎn)生噬菌斑。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程105、文庫的質(zhì)量檢測、文庫的質(zhì)量檢測克隆子數(shù)目要足夠多，覆蓋度要足夠高克隆子數(shù)目要足夠多，覆蓋度要足夠高(4-6倍或更高倍或更高)；文庫的文庫的滴度檢測滴度檢測：1微克包裝微

16、克包裝感染大腸桿菌后產(chǎn)生的噬菌斑感染大腸桿菌后產(chǎn)生的噬菌斑的數(shù)量的數(shù)量(pfu/g)，100萬以上萬以上才合格。才合格。平均插入片段長度平均插入片段長度：小片段文庫采用酶切法或：小片段文庫采用酶切法或PCR法結(jié)合電法結(jié)合電泳進行檢測，大片段文庫采用泳進行檢測，大片段文庫采用PFGE電泳進行檢測。電泳進行檢測。重組率重組率：有目標(biāo)片段插入的克隆子數(shù)占總克隆子數(shù)的百分比，：有目標(biāo)片段插入的克隆子數(shù)占總克隆子數(shù)的百分比，許多文庫的載體系統(tǒng)可以采用藍白斑鑒定重組率。許多文庫的載體系統(tǒng)可以采用藍白斑鑒定重組率。覆蓋度覆蓋度：覆蓋倍數(shù)：覆蓋倍數(shù) = 平均插入片段長度平均插入片段長度 克隆數(shù)克隆數(shù) / 基因

17、組基因組DNA的長度。的長度。 或：覆蓋倍數(shù)或：覆蓋倍數(shù)=所有探針篩選到的陽性克隆子數(shù)所有探針篩選到的陽性克隆子數(shù) / 總探針數(shù)?？偺结様?shù)。葉綠體葉綠體DNA的比例：小于的比例：小于5%。第二節(jié)第二節(jié) cDNAcDNA基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建一、一、cDNAcDNA文庫的特征和發(fā)展文庫的特征和發(fā)展：cDNA (complementary DNA):cDNA (complementary DNA):以以mRNAmRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成的與之反向互補的下合成的與之反向互補的DNADNA鏈鏈( (單鏈單鏈cDNAcDNA，反義鏈，反義鏈) )，以單鏈，以單鏈

18、cDNAcDNA為模板還可以合成其反向互補鏈為模板還可以合成其反向互補鏈( (取代取代mRNAmRNA的的DNADNA鏈，正鏈，正義鏈義鏈) )，得到雙鏈，得到雙鏈cDNAcDNA。將生物某一組織細胞中的總的將生物某一組織細胞中的總的mRNAmRNA分離出來作為模板，在分離出來作為模板，在體外體外用反轉(zhuǎn)錄酶合成用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補互補的雙鏈的雙鏈cDNAcDNA，然后連接到合適的載體上，然后連接到合適的載體上，并轉(zhuǎn)入宿主細胞。這種方法所形成的所有克隆的集合體叫并轉(zhuǎn)入宿主細胞。這種方法所形成的所有克隆的集合體叫cDNAcDNA文庫文庫。1 1）cDNAcDNA只含有對應(yīng)于成熟只含有對應(yīng)于成熟mRN

19、AmRNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)，不含啟動子、終止子、的轉(zhuǎn)錄區(qū)，不含啟動子、終止子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等。內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等。2 2）cDNAcDNA一般較短，平均長度一般較短，平均長度1.5kb1.5kb左右，多數(shù)為左右，多數(shù)為100bp100bp至至10kb10kb。3 3）表達譜的時空動態(tài)性決定了）表達譜的時空動態(tài)性決定了cDNAcDNA文庫的多樣性。文庫的多樣性。4 4）不同基因的）不同基因的cDNAcDNA間存在豐度上的差異。間存在豐度上的差異。二、二、cDNAcDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建：1 1、RNARNA的分離的分離 mRNAmRNA是構(gòu)建是構(gòu)建cDNAcDNA文庫的起始材料?？偽膸斓钠鹗?/p>

20、材料?？俁NARNA中絕大多數(shù)是中絕大多數(shù)是tRNAtRNA和和rRNArRNA，而，而mRNAmRNA只占總只占總RNARNA的的1 1-5-5，平均為平均為2%2%，mRNAmRNA的比的比例取決于細胞類型和細胞的生理狀態(tài)。由于例取決于細胞類型和細胞的生理狀態(tài)。由于mRNAmRNA在總在總RNARNA中所中所占比例很小，因此從總占比例很小，因此從總RNARNA中中富集富集mRNAmRNA是構(gòu)建是構(gòu)建cDNAcDNA文庫的一個文庫的一個重要步驟。通過降低重要步驟。通過降低rRNArRNA和和tRNAtRNA含量，可大大提高篩選到目含量，可大大提高篩選到目的基因的可能性。的基因的可能性。利用利

21、用Poly(A)Poly(A)尾巴純化或直接提取尾巴純化或直接提取mRNAmRNA。1 1）根據(jù)研究目標(biāo)合理選擇器官、組織和細胞類型以及合理的環(huán)）根據(jù)研究目標(biāo)合理選擇器官、組織和細胞類型以及合理的環(huán)境條件，用于提取境條件，用于提取RNARNA。2 2）保持）保持mRNAmRNA的完整性，是構(gòu)建全長的完整性，是構(gòu)建全長cDNAcDNA文庫的核心。文庫的核心。3 3）選取合適的提取方法，除完整性外，）選取合適的提取方法，除完整性外，mRNAmRNA還要求純度高、還要求純度高、DNADNA污染少，最好是采用無污染少，最好是采用無RNaseRNase的的DNaseDNase去除雜質(zhì)去除雜質(zhì)DNADNA

22、。4 4）RNARNA定量準確，保存合理。定量準確，保存合理。5 5）根據(jù)目標(biāo)和條件決定是否需要純化）根據(jù)目標(biāo)和條件決定是否需要純化mRNAmRNA或直接使用總或直接使用總RNARNA。2 2、第一鏈、第一鏈cDNAcDNA的合成的合成 由由mRNAmRNA到到cDNAcDNA的過程稱為的過程稱為反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄(reverse (reverse transcription,RT)transcription,RT)，由，由反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase, (reverse transcriptase, RTase)RTase)催化。反轉(zhuǎn)錄酶是依賴催化。反轉(zhuǎn)錄酶是依賴R

23、NARNA的的DNADNA聚合酶，合成聚合酶，合成DNADNA是是需要引物引導(dǎo)。常用的引物有：需要引物引導(dǎo)。常用的引物有：oligo(dT)oligo(dT)引物：在反應(yīng)體系中加入高濃度的引物：在反應(yīng)體系中加入高濃度的oligo(dT)oligo(dT)引物，引物， oligo(dT)oligo(dT)引物與引物與mRNA 3mRNA 3末端的末端的poly(A)poly(A)配對，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄配對，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以酶以mRNAmRNA為模板合成第一鏈為模板合成第一鏈cDNAcDNA，反轉(zhuǎn)錄的是整個表達譜，反轉(zhuǎn)錄的是整個表達譜，可以產(chǎn)生全長可以產(chǎn)生全長cDNAcDNA，應(yīng)用最廣。，應(yīng)用最廣。隨機引

24、物：與隨機引物：與mRNAmRNA分子內(nèi)的多處配對，從多個位置合成分子內(nèi)的多處配對，從多個位置合成cDNAcDNA第第一鏈，反轉(zhuǎn)錄的幾乎是整個表達譜，最多只能產(chǎn)生近全長一鏈，反轉(zhuǎn)錄的幾乎是整個表達譜，最多只能產(chǎn)生近全長cDNAcDNA，適合于得到總，適合于得到總cDNAcDNA的的55末端。末端?；蛱禺愐锘蛱禺愐?gene-specific primer, GSP)(gene-specific primer, GSP)：僅反轉(zhuǎn)錄特定：僅反轉(zhuǎn)錄特定目標(biāo)基因目標(biāo)基因cDNAcDNA的的55末端。末端。有有AMVAMV和和MMLVMMLV兩種兩種RTaseRTase，最適溫度分別為，最適溫度

25、分別為4242和和3737，需要敲，需要敲除其除其RNase HRNase H活性，較高溫度反轉(zhuǎn)錄有利于打開活性，較高溫度反轉(zhuǎn)錄有利于打開mRNAmRNA的二級的二級結(jié)構(gòu)，得到全長結(jié)構(gòu)，得到全長cDNAcDNA。反轉(zhuǎn)錄過程中要防止反轉(zhuǎn)錄過程中要防止mRNAmRNA降解，可以添加降解，可以添加RNaseRNase抑制劑。抑制劑。3 3、第二鏈、第二鏈cDNAcDNA的合成的合成cDNAcDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-cDNAmRNA-cDNA雜交雙鏈變成雜交雙鏈變成互補雙鏈互補雙鏈cDNAcDNA的過程。的過程。 4 4種種cDNAcDNA第二鏈合成

26、的方法：第二鏈合成的方法：自身引導(dǎo)合成法自身引導(dǎo)合成法：解離的：解離的cDNAcDNA第一鏈的第一鏈的33末端會產(chǎn)生一個發(fā)夾末端會產(chǎn)生一個發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，可以引導(dǎo)第二鏈的合成，然后用狀結(jié)構(gòu)，可以引導(dǎo)第二鏈的合成，然后用S1S1核酸酶處理去除核酸酶處理去除發(fā)夾結(jié)構(gòu)。得到的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。得到的55不完整，且不完整，且S1S1核酸酶處理不好控制，核酸酶處理不好控制，易導(dǎo)致易導(dǎo)致cDNAcDNA的丟失，所以該法現(xiàn)已少用。的丟失，所以該法現(xiàn)已少用。置換合成法置換合成法：RNase HRNase H、大腸桿菌、大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶、DNADNA連接酶聯(lián)合連接酶聯(lián)合處理，得到近全長處理，得到近全長cDN

27、AcDNA，55缺失短序列。缺失短序列。引導(dǎo)合成法引導(dǎo)合成法：利用末端轉(zhuǎn)移酶在：利用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNAcDNA第一鏈的第一鏈的33末端加上末端加上poly(dC)poly(dC)尾巴，利用尾巴，利用poly(dG)poly(dG)為引物引導(dǎo)第二鏈合成，利用為引物引導(dǎo)第二鏈合成，利用同源多聚尾與載體進行重組。同源多聚尾與載體進行重組。引物引物- -銜接頭合成法：引導(dǎo)合成法的改進型，在反轉(zhuǎn)錄引物和銜接頭合成法：引導(dǎo)合成法的改進型，在反轉(zhuǎn)錄引物和poly(dG)poly(dG)引物的引物的55引入優(yōu)化設(shè)計的人工接頭，可用引入優(yōu)化設(shè)計的人工接頭，可用PCRPCR擴增擴增廣大總廣大總cDNAcDNA，

28、也為總，也為總cDNAcDNA與載體的連接提供了酶切位點。與載體的連接提供了酶切位點。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程154 4、雙鏈、雙鏈cDNAcDNA克隆進質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖克隆進質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖反轉(zhuǎn)錄和第二鏈合成過程中為反轉(zhuǎn)錄和第二鏈合成過程中為cDNAcDNA兩端引物合理的兩端引物合理的人工接頭人工接頭序序列是關(guān)鍵（試劑盒），可以方便定向克隆和克隆子的處理。列是關(guān)鍵（試劑盒），可以方便定向克隆和克隆子的處理?？偪俢DNAcDNA的分級分離的分級分離：采用排阻層析柱，去除過大和過小的：采用排阻層析柱，去除過大和過小的cDNAcDNA分子，保留分子，保留50

29、0bp500bp至至8kb8kb的總的總cDNAcDNA，以提高連接后文庫的質(zhì)量。，以提高連接后文庫的質(zhì)量。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程16三、三、cDNAcDNA文庫的均一化處理文庫的均一化處理1 1、基因組、基因組DNADNA飽和雜交法飽和雜交法mRNAmRNA水平上，基因之間豐度差異極大。水平上，基因之間豐度差異極大。基因組水平，基因之間拷貝數(shù)差異不大?；蚪M水平，基因之間拷貝數(shù)差異不大。將隨機打斷的基因組總將隨機打斷的基因組總DNADNA片段標(biāo)記為探針，與總片段標(biāo)記為探針，與總cDNAcDNA單鏈飽單鏈飽和雜交，棄除未雜交的總和雜交，棄除未雜交的總cDNAcDNA，從，從cDNA-

30、DNAcDNA-DNA雜交體上變性釋雜交體上變性釋放除均一化后的總放除均一化后的總cDNAcDNA，轉(zhuǎn)化宿主。，轉(zhuǎn)化宿主。優(yōu)點是簡單，缺點是易導(dǎo)致部分基因優(yōu)點是簡單，缺點是易導(dǎo)致部分基因cDNAcDNA的丟失。的丟失。2 2、基于復(fù)性動力學(xué)原理的均一化處理、基于復(fù)性動力學(xué)原理的均一化處理二次復(fù)性動力學(xué)原理二次復(fù)性動力學(xué)原理(second-order kinetcs)(second-order kinetcs)：濃度大的組分：濃度大的組分復(fù)性所需時間短，濃度越小復(fù)性越遲。復(fù)性所需時間短，濃度越小復(fù)性越遲?？刂茝?fù)性時間，用羥基磷灰石柱將單鏈和雙鏈控制復(fù)性時間，用羥基磷灰石柱將單鏈和雙鏈cDNAcD

31、NA分開，保留分開，保留單鏈單鏈cDNAcDNA后轉(zhuǎn)化宿主。后轉(zhuǎn)化宿主。優(yōu)點是基因丟失較少、均一化效果好，缺點是操作難度大。優(yōu)點是基因丟失較少、均一化效果好，缺點是操作難度大。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程17四、扣除雜交四、扣除雜交cDNAcDNA文庫文庫利用分子雜交原理，去除非差異表達基因的利用分子雜交原理，去除非差異表達基因的cDNA，保留差異表，保留差異表達的基因的達的基因的cDNA用于制備文庫。用于制備文庫。tester: 待測樣本的總待測樣本的總cDNA。driver: 表達譜背景一致但不含目的基因的總表達譜背景一致但不含目的基因的總cDNA。tester與過量的與過量的driv

32、er雜交，用特定方法將二者共同表達的雜交，用特定方法將二者共同表達的cDNA去除。去除。1 1、抑制性扣除雜交、抑制性扣除雜交(suppression subtractive hybridization, SSH)為為Clontech公司的專利試劑盒原理，將公司的專利試劑盒原理，將tester打上兩組特定設(shè)打上兩組特定設(shè)計的接頭，分別與過量計的接頭，分別與過量driver進行第一輪雜交，然混合兩種進行第一輪雜交，然混合兩種雜交體系進行第二輪雜交，通過雜交體系進行第二輪雜交，通過PCR法特異擴增差異表達基法特異擴增差異表達基因的因的cDNA，特定接頭會通過鍋柄結(jié)構(gòu)而抑制非差異表達基，特定接頭會通

33、過鍋柄結(jié)構(gòu)而抑制非差異表達基因的因的PCR擴增。擴增。2 2、mRNA-cDNAmRNA-cDNA雜交雜交：過量的驅(qū)動總：過量的驅(qū)動總mRNA與總與總cDNA雜交，利用雜交，利用生物素磁珠法將公共表達基因去除。生物素磁珠法將公共表達基因去除。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程18五、全長五、全長cDNAcDNA文庫文庫cDNA不完整的原因：不完整的原因：mRNA的降解、第二鏈合成中的降解、第二鏈合成中DNA聚合聚合酶的外切核酶活性、反轉(zhuǎn)錄酶的特性的酶的外切核酶活性、反轉(zhuǎn)錄酶的特性的RNase H活性、反轉(zhuǎn)活性、反轉(zhuǎn)錄酶與錄酶與mRNA模板的脫離模板的脫離(主要受主要受mRNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)影響復(fù)雜結(jié)構(gòu)

34、影響)。1 1、SMARTSMART全長全長cDNAcDNA文庫的構(gòu)建方法文庫的構(gòu)建方法為為Clontech公司的專利試劑盒原理，應(yīng)用廣泛，其獨特的反轉(zhuǎn)公司的專利試劑盒原理，應(yīng)用廣泛，其獨特的反轉(zhuǎn)錄酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，錄酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性， RTase自動在反轉(zhuǎn)錄得到的全長自動在反轉(zhuǎn)錄得到的全長cDNA第一鏈的第一鏈的3末端加上末端加上oligo(dC)，利用具，利用具oligo(dG)的接的接頭引導(dǎo)第二鏈的合成。由于頭引導(dǎo)第二鏈的合成。由于oligo(dC)比較短，因此較短的比較短，因此較短的oligo(dG)容易介導(dǎo)合成假全長容易介導(dǎo)合成假全長cDNA。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程

35、192 2、Cap-TrapperCap-Trapper法構(gòu)建全長法構(gòu)建全長cDNAcDNA文庫文庫在在mRNA的兩端均打上生物素標(biāo)記，合成的兩端均打上生物素標(biāo)記，合成cDNA第一鏈時用第一鏈時用dm5 CTP代替代替dCTP，用，用RNase消化單鏈消化單鏈RNA。3 3、煙草酸性焦磷酸酶法構(gòu)建全長、煙草酸性焦磷酸酶法構(gòu)建全長cDNAcDNA文庫文庫Invitrogen公司的試劑盒原理，首先利用堿性磷酸酶處理使非公司的試劑盒原理，首先利用堿性磷酸酶處理使非全長全長mRNA無效化。用無效化。用煙草酸性焦磷酸酶煙草酸性焦磷酸酶(tobacco acid (tobacco acid pyropho

36、sphatease, TAP)pyrophosphatease, TAP)處理以移去全長處理以移去全長mRNA的帽子結(jié)構(gòu)，的帽子結(jié)構(gòu)，然后為脫帽后的全長然后為脫帽后的全長mRNA的的5末端接上人工接頭，利用具末端接上人工接頭，利用具oligo(dT)的人工接頭進行反轉(zhuǎn)錄，得到的全長的人工接頭進行反轉(zhuǎn)錄，得到的全長cDNA第一鏈第一鏈的兩端就打上了特別設(shè)計的人工接頭，可用的兩端就打上了特別設(shè)計的人工接頭，可用PCR法對全長總法對全長總cDNA進行放大，酶切后與載體連接。進行放大，酶切后與載體連接。優(yōu)點是理論上全部優(yōu)點是理論上全部cDNA都將是全長，缺點是操作的技術(shù)性強。都將是全長，缺點是操作的技

37、術(shù)性強。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程20六、其它六、其它cDNAcDNA文庫文庫表達表達cDNAcDNA文庫：用表達載體構(gòu)建全長文庫：用表達載體構(gòu)建全長cDNAcDNA文庫，文庫的每一個文庫，文庫的每一個克隆子可以表達出蛋白，利用蛋白對克隆子進行篩選?？寺∽涌梢员磉_出蛋白，利用蛋白對克隆子進行篩選。雙雜交全長雙雜交全長cDNAcDNA文庫：將表達文庫與酵母雙雜交系統(tǒng)結(jié)合使用，文庫：將表達文庫與酵母雙雜交系統(tǒng)結(jié)合使用，利用酵母作宿主，通過融合蛋白的酵母雙雜交對克隆子進行利用酵母作宿主，通過融合蛋白的酵母雙雜交對克隆子進行篩選，用于鑒定可與特定蛋白相互作用的基因，主要為轉(zhuǎn)錄篩選，用于鑒定可與特

38、定蛋白相互作用的基因，主要為轉(zhuǎn)錄因子。因子。重組酶克隆策略的重組酶克隆策略的cDNAcDNA文庫：將重組酶的特異識別序列文庫：將重組酶的特異識別序列attP1attP1和和attP2attP2構(gòu)建到每個構(gòu)建到每個cDNAcDNA的兩端，在非消化情況下實現(xiàn)與載體的的兩端，在非消化情況下實現(xiàn)與載體的重組連接，避免了基因被切斷。重組連接，避免了基因被切斷。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程21第三節(jié)第三節(jié) 基因克隆的篩選策略基因克隆的篩選策略大型基因組大型基因組文庫文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成，從一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成，從其中篩選分離出某一個特定基因并不是件簡單的事。其中篩選

39、分離出某一個特定基因并不是件簡單的事。一、表型篩選法一、表型篩選法一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以賦予宿主特定的表型，可以采用特殊的白編碼基因等）可以賦予宿主特定的表型，可以采用特殊的正選擇篩選正選擇篩選程序（如程序（如抗藥性篩選法抗藥性篩選法等）直接篩選，宿主多為等）直接篩選，宿主多為突變體。突變體。該法傳統(tǒng)多用于微生物基因的篩選。該法傳統(tǒng)多用于微生物基因的篩選。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程22二、雜交篩選和二、雜交篩選和PCR篩選篩選探針探針(probe)：用于通過分子雜交分離獲得目標(biāo)基因克隆

40、子的核：用于通過分子雜交分離獲得目標(biāo)基因克隆子的核酸片段酸片段。探針來源：基因本身的部分序列、異源物種的同源基因序列、探針來源：基因本身的部分序列、異源物種的同源基因序列、蛋白氨基酸序列反翻譯推導(dǎo)的核苷酸序列、分子標(biāo)記。蛋白氨基酸序列反翻譯推導(dǎo)的核苷酸序列、分子標(biāo)記。篩選種類：菌落雜交篩選、噬菌斑篩選。一般要多輪篩選。篩選種類：菌落雜交篩選、噬菌斑篩選。一般要多輪篩選。PCR篩選法：將文庫貯存于多個篩選法：將文庫貯存于多個384孔板中，首先通過孔板中，首先通過PCR確確定目標(biāo)基因所在的特定定目標(biāo)基因所在的特定PCR板板(主混合池篩選主混合池篩選)，然后通過，然后通過PCR確定目標(biāo)基因在特定確定

41、目標(biāo)基因在特定PCR板上的特定行和列板上的特定行和列(行混合池行混合池篩選和列混合池篩選篩選和列混合池篩選)，最后通過逐個克隆的，最后通過逐個克隆的PCR確定目標(biāo)確定目標(biāo)基因所對應(yīng)的克隆子。基因所對應(yīng)的克隆子。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程23三、免疫篩選三、免疫篩選首先制備和純化得到目標(biāo)基因的抗體，然后利用抗體來篩選目首先制備和純化得到目標(biāo)基因的抗體，然后利用抗體來篩選目標(biāo)基因所在的表達文庫，得到目標(biāo)基因所對應(yīng)的克隆子。方標(biāo)基因所在的表達文庫，得到目標(biāo)基因所對應(yīng)的克隆子。方法有原位檢測和免疫沉淀檢測。法有原位檢測和免疫沉淀檢測。四、酵母雙雜交系統(tǒng)四、酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交酵母雙雜交(ye

42、ast two hybrid system)：研究蛋白與蛋白相互：研究蛋白與蛋白相互作用，主要為轉(zhuǎn)錄因子之間的互作。作用，主要為轉(zhuǎn)錄因子之間的互作。轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子(如酵母的如酵母的GAL4)一般具有兩個結(jié)構(gòu)域：一般具有兩個結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域結(jié)合域(DNA binding domain, BD)和激活結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, AD)。已知蛋白已知蛋白X與與BD融合融合(BD-X，誘餌，誘餌, bait)，未知蛋白，未知蛋白Y與與AD融融合合(AD-Y，獵物，獵物, prey)，當(dāng)，當(dāng)X與與Y存在互作時，存在互作時，BD與與AD接近接近并啟動報告基因轉(zhuǎn)錄表達，否

43、則不表達。并啟動報告基因轉(zhuǎn)錄表達，否則不表達。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程24密集鋪板（密集鋪板（1-10萬）萬）雜交雜交挖取挖取鋪板鋪板鋪板鋪板目的重組克隆目的重組克隆西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程25基因組文庫重組克隆的排序基因組文庫重組克隆的排序 大型基因文庫（包括人的基因文庫）的構(gòu)建在技術(shù)上并大型基因文庫（包括人的基因文庫）的構(gòu)建在技術(shù)上并不十分困難，如果一個不十分困難，如果一個YAC基因文庫的插入片段總和為整基因文庫的插入片段總和為整個基因組的十倍以上時，一般就能從基因文庫中調(diào)出任何個基因組的十倍以上時，一般就能從基因文庫中調(diào)出任何一段一段DNA序列。然而基因文庫的克隆都是隨機

44、序列，必須序列。然而基因文庫的克隆都是隨機序列，必須將所有的克隆排列成一個像天然染色體將所有的克隆排列成一個像天然染色體DNA上所表現(xiàn)出的上所表現(xiàn)出的信息順序。這項工作的工作量可能遠大于基因組文庫的構(gòu)信息順序。這項工作的工作量可能遠大于基因組文庫的構(gòu)建，屬于基因文庫的后期制作。建，屬于基因文庫的后期制作。西南大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè) 基因工程26 將單一的將單一的YAC克隆插入克隆插入DNA片段片段用限制性內(nèi)切酶分布用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素。均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素。 然后再用然后再用Sau3AI或或MboI將末端標(biāo)記的將末端標(biāo)記的DNA片段降解成片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每10個個YAC克隆走在同一塊克隆走在同一塊板上，形成板上，形成1010個克隆的特征性個克隆的特征性DNA指紋圖譜。指紋圖譜。 電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個克隆電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個克隆DNA的指紋的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個圖譜有部分相同的，則其兩個YAC片段就有互相重疊的可片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個能性，于是這兩個YAC克隆的克隆的DNA片段克隆在染