細(xì)胞生物學(xué)研究方法ppt課件

1、METHODS AND TECHNIQUES本章內(nèi)容提要本章內(nèi)容提要 第一節(jié)第一節(jié) 顯微技術(shù)顯微技術(shù) 一、光學(xué)顯微鏡一、光學(xué)顯微鏡 二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡 三、顯微操作技術(shù)三、顯微操作技術(shù) 第二節(jié)第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù) 第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞分別技術(shù)細(xì)胞分別技術(shù) 第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞培育與細(xì)胞雜交細(xì)胞培育與細(xì)胞雜交第一節(jié)第一節(jié) 顯微技術(shù)顯微技術(shù) 光學(xué)顯微鏡：以可見(jiàn)光或紫外線為光源。光學(xué)顯微鏡：以可見(jiàn)光或紫外線為光源。 電子顯微鏡：以電子束為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。、光學(xué)顯微鏡、光學(xué)顯微鏡 1. 1. 構(gòu)成：構(gòu)成： 照明系統(tǒng)照明系統(tǒng) 光學(xué)放大系統(tǒng)光學(xué)放

2、大系統(tǒng) 機(jī)械安裝機(jī)械安裝 2. 2. 原理：經(jīng)物鏡構(gòu)成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大原理：經(jīng)物鏡構(gòu)成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。成像。一普通光學(xué)顯微鏡一普通光學(xué)顯微鏡 3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的才干。分辨力：指分辨物體最小間隔的才干。 D=0.61/N*A 其中其中為入射光線波長(zhǎng)；為入射光線波長(zhǎng)；A為鏡口率為鏡口率 sin/2， N 介質(zhì)折射率；介質(zhì)折射率；=鏡口角樣品對(duì)物鏡鏡口的鏡口角樣品對(duì)物鏡鏡口的張角張角 思索：如何提高顯微鏡的分辨才干？思索：如何提高顯微鏡的分辨才干？表一、幾種介質(zhì)的折射率表一、幾種介質(zhì)的折射率 顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)：顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)： 制造光學(xué)鏡頭所用的玻

3、璃折射率為制造光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.651.78，所，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。 sin /2的最大值必然小于的最大值必然小于1；介質(zhì)為空氣，鏡口；介質(zhì)為空氣，鏡口率普通為率普通為0.050.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近口率可接近1.5。 普通光線的波長(zhǎng)為普通光線的波長(zhǎng)為400700nm，分辨力數(shù)值不會(huì)，分辨力數(shù)值不會(huì)小于小于0.2m，人眼的分辨力為，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微，因此顯微鏡的最大設(shè)計(jì)倍數(shù)為鏡的最大設(shè)計(jì)倍數(shù)為1000X。二熒光顯微鏡二熒光顯微鏡 Fluorescence Fluoresc

4、ence microscope P53microscope P53特點(diǎn)：光源為紫外線，波特點(diǎn)：光源為紫外線，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；顯微鏡；有兩個(gè)特殊的濾光片；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。照明方式通常為落射式。Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green 用于察看能激發(fā)出熒光的構(gòu)造。用途：免疫熒光用于察看能激發(fā)出熒光的構(gòu)造。用途：免疫熒光察看、基因定位、疾病診斷。察看、基因定位、疾病診斷。三激光共聚焦掃描顯微境三激光共聚焦掃描顯微境 Laser

5、 confocal scanning microscope, LCSM P53 用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。 能顯示細(xì)胞樣品的立體構(gòu)造。能顯示細(xì)胞樣品的立體構(gòu)造。 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。倍。 用途類(lèi)似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，構(gòu)成用途類(lèi)似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，構(gòu)成立體圖像。立體圖像。laser confocal scanning microscope, LCSMLCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) a

6、nd the nucleus (blue) /四暗視野顯微鏡四暗視野顯微鏡 dark field microscopedark field microscope 聚光鏡中央有擋光片，照明光聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因此視野的背景是黑的，鏡，因此視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。物體的邊緣是亮的。 可察看可察看 4200nm4200nm的微粒子，分的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高辨率比普通顯微鏡高5050倍。倍。 把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種

7、構(gòu)把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種構(gòu)造間的對(duì)比度，使各種構(gòu)造變得明晰可見(jiàn)。在構(gòu)造上，相差顯造間的對(duì)比度，使各種構(gòu)造變得明晰可見(jiàn)。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處：微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處： 環(huán)形光闌環(huán)形光闌annular diaphragm：位于光源與聚光器之間。：位于光源與聚光器之間。 相位板相位板annular phaseplate：物鏡中加了涂有氟化鎂的相：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。五相差顯微鏡五相差顯微鏡 P51原理原理用途：察看未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本用途：察看

8、未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本六偏光顯微鏡六偏光顯微鏡polarizing microscope 用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。原、染色體等。 光源前有偏振片起偏器，使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏光源前有偏振片起偏器，使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器振光，鏡筒中有檢偏器 與起偏器方向垂直的偏振與起偏器方向垂直的偏振片。片。 載物臺(tái)是可以旋轉(zhuǎn)。載物臺(tái)是可以旋轉(zhuǎn)。淀粉七微分干涉差顯微鏡七微分干涉差顯微鏡 Differential interference contrast microscope DICP52 1952年，年，No

9、marski發(fā)明，利發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示構(gòu)造的三維立體投影。標(biāo)示構(gòu)造的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。更大，故影像的立體感更強(qiáng)。八倒置顯微鏡八倒置顯微鏡 inverse microscope 物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于察看培載物臺(tái)之上，用于察看培育的活細(xì)胞，通常具有相育的活細(xì)胞，通常具有相差物鏡，有的還具有熒光差物鏡，有的還具有熒光安裝。安裝。 九當(dāng)代顯微鏡的開(kāi)展趨勢(shì)九當(dāng)代顯

10、微鏡的開(kāi)展趨勢(shì) 采用組合方式，集普采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、通光鏡加相差、熒光、暗視野、暗視野、DIC、攝影、攝影安裝于一體。安裝于一體。 自動(dòng)化與電子化。自動(dòng)化與電子化。二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡 P57一透射電子顯微鏡一透射電子顯微鏡transmission electron microscope, TEM 以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束的波長(zhǎng)短，并且以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束的波長(zhǎng)短，并且波長(zhǎng)與加速電壓波長(zhǎng)與加速電壓(通常通常50120KV)的平方根成反比。的平方根成反比。 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、

11、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。部分構(gòu)成。 分辨力分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍。，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍。 用于察看超微構(gòu)造用于察看超微構(gòu)造ultrastructure，即小于，即小于0.2m、光、光學(xué) 顯 微 鏡 下 無(wú) 法 看 清 的 構(gòu) 造 ， 又 稱 亞 顯 微 構(gòu) 造學(xué) 顯 微 鏡 下 無(wú) 法 看 清 的 構(gòu) 造 ， 又 稱 亞 顯 微 構(gòu) 造submicroscopic structures。1. 原理原理透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM表二、不同光線的波長(zhǎng)表二、不同光線的波長(zhǎng)2、制樣技

12、術(shù)、制樣技術(shù) P57 1超薄切片超薄切片 電子束穿透力很弱，用于電鏡察看的標(biāo)本須制成厚度僅電子束穿透力很弱，用于電鏡察看的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機(jī)的超薄切片，用超薄切片機(jī)ultramicrotome制制造。造。 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬鈾、鉛包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬鈾、鉛鹽染色。鹽染色。2負(fù)染技術(shù)負(fù)染技術(shù) P60 用重金屬鹽(如磷鎢酸)對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，枯燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸出的地方?jīng)]有染料堆積，從而

13、出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。Negative Stained Actin3冰凍蝕刻冰凍蝕刻 freeze-etching P60 亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開(kāi)，升溫后，冰升華，暴顯露了斷面構(gòu)造。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來(lái)，此膜即為復(fù)膜replica。A Yeast Cell 20世紀(jì)世紀(jì)60年代問(wèn)世，用來(lái)察看標(biāo)本外表構(gòu)造。年代問(wèn)世，用來(lái)察看標(biāo)本外表構(gòu)造。 分辨力為分辨力為610nm，由于人眼的分辨力區(qū)別熒光屏上間，由于人眼的分辨力區(qū)別熒光屏上間隔最近兩個(gè)光點(diǎn)的才干為隔最近兩個(gè)光點(diǎn)的才干為0.2mm，掃描電鏡的有效放大，掃描電

14、鏡的有效放大倍率為倍率為0.2mm/10nm=20000X。二掃描電子顯微鏡二掃描電子顯微鏡SEM P62Scanning electron microscope SEM 任務(wù)原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品外表任務(wù)原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品外表激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品外表構(gòu)造有關(guān)，激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品外表構(gòu)造有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器搜集，信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電次級(jí)電子由探測(cè)器搜集，信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 為了使標(biāo)本外表發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、

15、脫水后，為了使標(biāo)本外表發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。級(jí)電子信號(hào)。掃描電子顯微鏡原理掃描電子顯微鏡原理人類(lèi)紅細(xì)胞人類(lèi)紅細(xì)胞酵母酵母人類(lèi)精子人類(lèi)精子三掃描隧道顯微鏡三掃描隧道顯微鏡 P63scanning tunneling microscope，STM 原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓壓2mV2V，針尖與樣品之間

16、構(gòu)成隧道電流。電流強(qiáng)，針尖與樣品之間構(gòu)成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的間隔有函數(shù)關(guān)系，將掃描過(guò)程中電流度與針尖和樣品間的間隔有函數(shù)關(guān)系，將掃描過(guò)程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子程度的凹凸形狀。的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子程度的凹凸形狀。 分辨率：橫向?yàn)榉直媛剩簷M向?yàn)?.10.2nm，縱向可達(dá)，縱向可達(dá)0.001nm。 用途：三態(tài)固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)物質(zhì)均可進(jìn)展察看。用途：三態(tài)固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)物質(zhì)均可進(jìn)展察看。掃描隧道顯微鏡原理掃描隧道顯微鏡原理STM image, Benzene molecules accumulate at step edges on Cu三、顯微操作技術(shù)三、顯

17、微操作技術(shù)micromanipulation technique 在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)展細(xì)胞或早期胚胎操作在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)展細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)挪動(dòng)的機(jī)械安裝。視野內(nèi)挪動(dòng)的機(jī)械安裝。 顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。胚胎移植以及顯微切割等。 細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，Gordon等人等人1962對(duì)非洲爪蟾進(jìn)展核移植獲得勝利。我國(guó)著名學(xué)者童第

18、周等對(duì)非洲爪蟾進(jìn)展核移植獲得勝利。我國(guó)著名學(xué)者童第周等上個(gè)世紀(jì)上個(gè)世紀(jì)70年代在魚(yú)類(lèi)細(xì)胞核移植方面進(jìn)展了許多任務(wù)，年代在魚(yú)類(lèi)細(xì)胞核移植方面進(jìn)展了許多任務(wù)，并獲得了豐盛成果。并獲得了豐盛成果。顯微操作儀顯微操作儀第二節(jié)第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法histochemical and cytochemical staining method用于對(duì)用于對(duì)某些細(xì)胞成分進(jìn)展定性和定位研討。某些細(xì)胞成分進(jìn)展定性和定位研討。一固定一固定物理固定：血膜空氣快速枯燥、冷凍枯燥。物理固定：血膜空氣快速枯燥

19、、冷凍枯燥。化學(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛化學(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類(lèi)多用甲醛丙酮緩沖液固定。類(lèi)多用甲醛丙酮緩沖液固定。二顯示方法二顯示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反響產(chǎn)物最金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反響產(chǎn)物最終生成終生成CoS或或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。有色沉淀，而顯示出酶活性。Schiff反響：細(xì)胞中的醛基可使反響：細(xì)胞中的醛基可使Schiff試劑中的無(wú)色品試劑中的無(wú)色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸Fe

20、ulgen反反響。響。聯(lián)苯胺反響：過(guò)氧化酶分解聯(lián)苯胺反響：過(guò)氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再。產(chǎn)生新生氧，后者再將無(wú)色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。將無(wú)色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類(lèi)而使脂類(lèi)顯色。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類(lèi)而使脂類(lèi)顯色。茚三酮反響：顯示蛋白質(zhì)。茚三酮反響：顯示蛋白質(zhì)。二、免疫細(xì)胞化學(xué)二、免疫細(xì)胞化學(xué) immunocytochemistry 根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專注結(jié)合，對(duì)抗原根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專注結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)展定位測(cè)定的技術(shù)。常用的標(biāo)志物有熒光素和酶。進(jìn)展定位測(cè)定的技術(shù)。常用的標(biāo)志

21、物有熒光素和酶。 免疫熒光法免疫熒光法immunofluorescent technique：常用的：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。 酶標(biāo)免疫法酶標(biāo)免疫法enzyme-labeled antibody method：常：常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶，酶與底物發(fā)生反響后構(gòu)成不透用的酶有辣根過(guò)氧化物酶，酶與底物發(fā)生反響后構(gòu)成不透明的堆積物，從而顯示出抗原存在的部位。明的堆積物，從而顯示出抗原存在的部位。三、顯微光譜分析技術(shù)三、顯微光譜分析技術(shù) 細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有本

22、人特征性的蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有本人特征性的吸收曲線。吸收曲線。 可利用顯微分光光度計(jì)對(duì)某些成分進(jìn)展定位、定可利用顯微分光光度計(jì)對(duì)某些成分進(jìn)展定位、定性和定量測(cè)定。性和定量測(cè)定。四、放射自顯影術(shù)四、放射自顯影術(shù) 用于研討標(biāo)志化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、用于研討標(biāo)志化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。 原理：將放射性同位素標(biāo)志的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過(guò)原理：將放射性同位素標(biāo)志的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，一段時(shí)間后，制取切片，涂上鹵化銀乳

23、膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。使乳膠感光。 普通用普通用14C和和3H標(biāo)志。常用標(biāo)志。常用3H-TDR來(lái)顯示來(lái)顯示DNA，用，用3H-UDR顯示顯示RNA；用；用3H氨基酸研討蛋白質(zhì)，用氨基酸研討蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、甘露糖、3H巖藻糖研討多糖。巖藻糖研討多糖。 14C半衰期為半衰期為5730年，年，3H為為12.5年。年。五、分子雜交技術(shù)五、分子雜交技術(shù) 具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，經(jīng)過(guò)氫鍵結(jié)合，構(gòu)成條件下，經(jīng)過(guò)氫鍵結(jié)合，構(gòu)成DNA-DNA，DNA-RNA或或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來(lái)測(cè)定單鏈分

24、子雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來(lái)測(cè)定單鏈分子核苷酸序列間能否具有互補(bǔ)關(guān)系。核苷酸序列間能否具有互補(bǔ)關(guān)系。 一原位雜交一原位雜交in situ hybridization。 用于檢測(cè)染色體上的特殊用于檢測(cè)染色體上的特殊DNA序列。最初是運(yùn)用帶放射性序列。最初是運(yùn)用帶放射性的的DNA探針，后來(lái)又發(fā)明了免疫探針?lè)?。探針，后?lái)又發(fā)明了免疫探針?lè)?。二二Southern雜交雜交 是體外分析特異是體外分析特異DNA序列的方法，操作時(shí)先用限序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體或線粒體DNA切成切成DNA片段，片段，經(jīng)凝膠電泳分別后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再經(jīng)凝膠電泳分別后，轉(zhuǎn)移到

25、醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，經(jīng)過(guò)放射自顯影，即可識(shí)別出與探用探針雜交，經(jīng)過(guò)放射自顯影，即可識(shí)別出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。針互補(bǔ)的特殊核苷序列。 將將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，那么稱為轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，那么稱為Northern雜交。雜交。第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞分別技術(shù)細(xì)胞分別技術(shù)一、離心技術(shù)一、離心技術(shù) 是分別細(xì)胞器如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體及各是分別細(xì)胞器如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體及各種大分子根本手段。種大分子根本手段。 轉(zhuǎn)速為轉(zhuǎn)速為1025kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力，離心力89K者稱為超速離心機(jī)。者稱為超速離心

26、機(jī)。 目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心，離心力超越力超越500Kg。 一差速離心一差速離心 Differential centrifugation 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 介質(zhì)密度均一；介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，逐級(jí)離心。速度由低向高，逐級(jí)離心。 用途：分別大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。用途：分別大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。 沉降順序：核沉降順序：核線粒體線粒體溶酶體與過(guò)氧化物酶體溶酶體與過(guò)氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。核蛋白體。 可將細(xì)胞器初步分別，常需進(jìn)一步經(jīng)過(guò)密度梯離心再行分可將細(xì)胞器初步分別，常需進(jìn)一步經(jīng)過(guò)密度梯離心再行分別

27、純化。別純化。 Low speedHigh speedDifferential centrifugation二密度梯度離心二密度梯度離心 用介質(zhì)在離心管內(nèi)構(gòu)成一延續(xù)或不延續(xù)的密度梯度，將細(xì)用介質(zhì)在離心管內(nèi)構(gòu)成一延續(xù)或不延續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，經(jīng)過(guò)離心力場(chǎng)的作用使胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，經(jīng)過(guò)離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分別。細(xì)胞分層、分別。 類(lèi)型：速度沉降、等密度沉降。類(lèi)型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分別活細(xì)胞的介質(zhì)要求：分別活細(xì)胞的介質(zhì)要求： 1能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；能產(chǎn)生密度梯度

28、，且密度高時(shí)，粘度不高； 2pH中性或易調(diào)為中性；中性或易調(diào)為中性； 3濃度大時(shí)浸透壓不大；濃度大時(shí)浸透壓不大； 4對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。1、速度沉降、速度沉降 velocity sedimentation 用途：分別密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。用途：分別密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。 特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分別生物顆粒的最小密度。分別生物顆粒的最小密度。 原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分別物按各自的沉降原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分別物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而到達(dá)分別。系數(shù)以不同的速度沉降而到達(dá)分別。2.等密度沉降等密

29、度沉降 isopycnic sedimentation 用途：分別密度不等的顆粒。用途：分別密度不等的顆粒。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分別組分的最大密度。別組分的最大密度。 所需的力場(chǎng)通常比速率沉降法大所需的力場(chǎng)通常比速率沉降法大10100倍，往往需求倍，往往需求高速或超速離心。高速或超速離心。 原理：樣品各成分在延續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過(guò)一定時(shí)間原理：樣品各成分在延續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的離心那么沉降到與本身密度相等的介質(zhì)處，并停留的離心那么沉降到與本身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里到達(dá)平衡，從而將不同密度的成分分

30、別。在那里到達(dá)平衡，從而將不同密度的成分分別。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation二、流式細(xì)胞術(shù)二、流式細(xì)胞術(shù) 用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)展快速定量分析與分選的一門(mén)技術(shù)。用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)展快速定量分析與分選的一門(mén)技術(shù)。 原理：包在鞘液中的細(xì)胞經(jīng)過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，構(gòu)成原理：包在鞘液中的細(xì)胞經(jīng)過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，構(gòu)成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處置，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)

31、這些性質(zhì)分選出高純度機(jī)處置，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分別純度可達(dá)的細(xì)胞亞群，分別純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)flow cytometer。第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞培育與細(xì)胞雜交細(xì)胞培育與細(xì)胞雜交一、細(xì)胞培育一、細(xì)胞培育一動(dòng)物細(xì)胞培育一動(dòng)物細(xì)胞培育 群體培育群體培育mass culture：將含有一定數(shù)量：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培育瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞的懸液置于培育瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，集合集合confluence后構(gòu)成均勻的單細(xì)胞層；后構(gòu)成均勻的單細(xì)胞層； 克隆培育克隆培育cl

32、onal culture：培育高度稀釋：培育高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞構(gòu)成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。原代培育原代培育 primary culture即：培育直接來(lái)自動(dòng)物機(jī)即：培育直接來(lái)自動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞群，將細(xì)胞從一個(gè)培育瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培育瓶體的細(xì)胞群，將細(xì)胞從一個(gè)培育瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培育瓶稱為傳代或傳代培育稱為傳代或傳代培育Passage。細(xì)胞株細(xì)胞株cell strain：從原代培育細(xì)胞群中挑選出的具：從原代培育細(xì)胞群中挑選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。細(xì)胞系細(xì)胞系cell line

33、：從腫瘤組織培育建立的細(xì)胞群或培：從腫瘤組織培育建立的細(xì)胞群或培育過(guò)程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可無(wú)限繁衍。育過(guò)程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可無(wú)限繁衍。 克隆克隆clone：亦稱無(wú)性系。指由同一個(gè)祖先細(xì)胞經(jīng)過(guò)：亦稱無(wú)性系。指由同一個(gè)祖先細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞系細(xì)胞系名稱細(xì)胞系名稱細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞類(lèi)型來(lái)源來(lái)源3T3成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞小鼠小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞宮頸癌上皮細(xì)胞Henrietta Lacks BHK21成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞敘利亞倉(cāng)鼠敘利亞倉(cāng)鼠PtKl上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞袋鼠袋鼠L6成肌細(xì)胞成肌細(xì)胞大鼠大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞嗜鉻細(xì)胞大鼠大鼠SP2漿細(xì)胞漿細(xì)胞小鼠小鼠SP20骨髓瘤漿細(xì)胞骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠小鼠CHO卵巢細(xì)胞卵巢細(xì)胞中國(guó)地鼠中國(guó)地鼠