總RNA提取及QPCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程

1、總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、儀器試劑Trizol試劑三氯甲烷（4預(yù)冷）異丙醇（4預(yù)冷）75%乙醇（DEPC處理水配置）（4預(yù)冷）DEPC處理水/RNase free water（反轉(zhuǎn)錄試劑盒）1.5mL無(wú)酶EP管200L無(wú)酶PCR管冷凍離心機(jī)Nano Drop 2000反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara RR036A）二、實(shí)驗(yàn)須知1. 選擇人員走動(dòng)較少的實(shí)驗(yàn)臺(tái)或超凈臺(tái)（無(wú)須打開(kāi)風(fēng)機(jī)）操作。2. 操作及觀摩人員必須佩戴干凈的一次性手套及口罩。3. 盡可能在冰盤(pán)上操作。3. 取EP管時(shí)需用鑷子，不可以用使用過(guò)的手套直接取用。取完EP管后，袋子及時(shí)封好。4. Trizol含劇毒，若濺到皮膚上，請(qǐng)立即

2、用清水沖洗；若濺到眼內(nèi)，立即大量清水沖洗，并送醫(yī)就診。三、樣品處理1. 組織樣品將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol溶液，混勻，室溫放置5min使其充分裂解。注1：樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%。注2：組織樣品收取后應(yīng)立即處理或液氮冷凍并-80攝氏度保藏。胰腺組織樣品因其各種酶含量極其豐富，應(yīng)尤為注意，研磨過(guò)程中注意保持樣品低溫狀態(tài)。2. 貼壁細(xì)胞樣品棄去細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，根據(jù)下表加入適量 Trizol溶液，吹打混勻，并吸至1.5ml 無(wú)酶EP管中，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。培養(yǎng)皿Trizol體積3.5cm皿（6孔板）1mL6cm

3、皿3mL10cm皿10mL注：加入Trizol溶液后，可將培養(yǎng)皿放入-80冰箱，20min后取出化開(kāi)，通過(guò)凍融增加細(xì)胞裂解效果。3. 懸浮細(xì)胞500g×5min離心收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，約5-10×106細(xì)胞加入1mLTrizol溶液，吹打混勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。注：某些酵母或細(xì)菌細(xì)胞須超聲裂解。4. 注意事項(xiàng)1）樣品裂解液可室溫存放數(shù)小時(shí)，-80可至少存放一月。2）若樣品含大量脂肪、蛋白、多糖及包外物質(zhì)，如脂肪、肌肉或塊莖植物等樣品，可增加一步離心操作，具體步驟如下： 12000g、4離心10min，胞外基質(zhì)、多糖、高分子量DNA將會(huì)形成顆粒沉淀于底部，R

4、NA包含于上清中，而高脂樣品會(huì)在上清液上方形成一層脂肪層。 移除脂肪層，將澄清的上清液移至新的無(wú)酶EP管中。四、總RNA提取1. 每1mL Trizol溶液加入200L三氯甲烷，立即蓋上蓋子，劇烈振蕩15s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置3-5min。2. 4下，12000g離心15min，液體分為三層，RNA位于上層水相，約占總體積的50%，移至新無(wú)酶EP管中（用20-200L的槍吸取上清，吸上清時(shí)，EP管傾斜大約45度，槍頭應(yīng)沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層）。3. 加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次，不應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜置10min。4下，12,000g

5、離心10min，可見(jiàn)羽毛狀白色RNA沉淀，小心吸出上清。4. 1mL 75%乙醇洗滌兩次（4 7500g離心5min，加入乙醇后只需輕輕顛倒EP管即可，不可使用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀）。注：RNA可與75%乙醇中4保存一周，-80保存一年。5. 室溫干燥室溫或真空干燥5-10min，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。視沉淀量加入適量DEPC水（至少15L）溶解沉淀，使用Nano Drop測(cè)定RNA濃度。6. 首次提取RNA時(shí)須跑膠驗(yàn)證RNA質(zhì)量，核酸膠配置為：1%瓊脂糖/1×TAE緩沖液，取5LRNA溶液混上0.5L Loading Buffer，上樣跑膠，電泳大概15m

6、in，凝膠成像儀上觀察RNA條帶質(zhì)量，RNA條帶一般為三條，理想的RNA條帶為：明亮的28S條帶與18S條帶，并且28S條帶亮度大約為18S條帶兩倍，微弱或沒(méi)有5S條帶。五、反轉(zhuǎn)錄用Prime Script TM反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara RR036A）將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。1. 于200L無(wú)酶PCR管中按反應(yīng)體系配置RT液。反應(yīng)體系如下：試劑使用量終濃度5× Prime Script RT Master Mix（Perfect Real Time）2L1×總RNA500ngDEPC處理水補(bǔ)足至10L2. 輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄應(yīng) ，條件如下：37 15min （反轉(zhuǎn)錄

7、反應(yīng)）85 5sec （反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)）43. 得到的RT反應(yīng)液使用Nano Drop測(cè)定cDNA濃度，-20保存。QPCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、QPCR原理所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行絕對(duì)定量分析或通過(guò)內(nèi)參對(duì)比進(jìn)行相對(duì)定量分析的方法。本實(shí)驗(yàn)室常采用相對(duì)定量進(jìn)行分析。1. SYBR Green：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性結(jié)合DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號(hào)，而游離SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。2. Ct

8、 值Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。1）熒光閾值（threshold）的設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺?。J(rèn)）設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10×SD cycle 3-15。2）Ct值與起始模板的關(guān)系每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下：Ct=-1/lg(1+e)×lgX0+lgN/lg(1+e)n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，e為擴(kuò)增效率，常默認(rèn)為1，N為熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)

9、到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。二、儀器試劑SYBR Green PCR Master Mix引物ddH2OcDNA模板EP管96孔板迷你離心機(jī) 7200RPM（TOMOS TMC15287）離心機(jī)（湘儀 L530）QPCR儀（伯樂(lè) Q200）三、QPCR操作步驟1. QPCR每孔體系如下：試劑使用量cDNA模板10pg-100ngSYBR Green PCR Master Mix10L上游引物1L下游引物1LddH2O補(bǔ)足至20L 根據(jù)樣品數(shù)量計(jì)算所需體系預(yù)混液體積（預(yù)混液中不包含cDNA模板），并按組分比例配置，振蕩器振蕩或用槍吹打均勻，迷你離心機(jī)快速離心去除氣泡。cDNA模板根據(jù)使用量用ddH

10、2O稀釋到合適的濃度。2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，小心地將體系與cDNA模板加入每孔之內(nèi)。例如：兩組樣品：對(duì)照組、處理組，每組樣品三個(gè)樣，檢測(cè)目的基因表達(dá)量，綠色部分表示檢測(cè)內(nèi)參基因表達(dá)量，藍(lán)色部分表示檢測(cè)目的基因表達(dá)量，96孔板設(shè)置如下：123456789101112A對(duì)照組1對(duì)照組1對(duì)照組1對(duì)照組1對(duì)照組1對(duì)照組1B對(duì)照組2對(duì)照組2對(duì)照組2對(duì)照組2對(duì)照組2對(duì)照組2C對(duì)照組3對(duì)照組3對(duì)照組3對(duì)照組3對(duì)照組3對(duì)照組3D處理組1處理組1處理組1處理組1處理組1處理組1E處理組2處理組2處理組2處理組2處理組2處理組2F處理組3處理組3處理組3處理組3處理組3處理組3GH1)樣品全都稀釋至50 ng/L，

11、模板量采用100ng，即每孔須加樣2L。2)預(yù)混液1：內(nèi)參基因18個(gè)孔，我們配置20個(gè)孔體系，即200L SYBR Green PCR Master Mix，20L內(nèi)參基因上游引物，20L內(nèi)參基因下游引物，ddH2O120L。預(yù)混液2：目的基因18個(gè)孔，我們配置20個(gè)孔體系，即200L SYBR Green PCR Master Mix，20L目的基因上游引物，20L目的基因下游引物，ddH2O120L。注：配置預(yù)混液時(shí)須適當(dāng)多配，EP管及槍頭易附著預(yù)混液引起損失，例如18個(gè)孔可配置20-22孔的預(yù)混液。3)根據(jù)96孔板設(shè)置，分別將預(yù)混液加入孔內(nèi)，同一預(yù)混液不需換槍頭，注意不要將槍打到第二檔，

12、避免產(chǎn)生氣泡。4)根據(jù)96孔板設(shè)置，分別將樣品加入孔內(nèi)，每一孔都必須換槍頭，避免交叉污染。封上封口膜，用硬卡片左右上下來(lái)回刮幾下，使封口膜與96孔板貼緊，避免交叉污染，離心機(jī)1500g×2min離心。3. 上QPCR儀進(jìn)行反應(yīng)分析，反應(yīng)程序如下Step 1 95 30secStep 2 95 5 secStep3 60 30sec設(shè)置Step2-3 39個(gè)循環(huán)Step4 添加溶解曲線注：該反應(yīng)程序僅是一般性建議，如有需要請(qǐng)根據(jù)具體情況優(yōu)化。4. 數(shù)據(jù)導(dǎo)出，進(jìn)行定量分析。相對(duì)定量分析舉例如下：內(nèi)參(Ct)基因（Ct）CtCt2-Ct對(duì)照組22.4527.224.774.77-4.77=02-0=1處理組123.8130.376.566.56-4.77=1.792-1.79=0.2892處理組223.7628.554.794.79-4.77=0.022-0.02=0.9862第一步計(jì)算 Ct=基因Ct值-內(nèi)參Ct值第二步計(jì)算 Ct=處理組Ct-對(duì)照組Ct第三步計(jì)算 2-Ct最后結(jié)果對(duì)照是1，處理小于1，說(shuō)明該基因表達(dá)下調(diào)。注：