b第二章微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

1、Chapter 2 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism微生物發(fā)酵產(chǎn)酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶1酶的生產(chǎn)方法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學(xué)合成(chemicalsynthesis)SOD - bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from Asperg

2、illusPlant cell cultureAnimal cell cultureFew example微生物發(fā)酵產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶2Contents of chapter 21、酶生物合成過(guò)程2、常見(jiàn)產(chǎn)酶微生物4、酶的發(fā)酵工藝條件及控制5、酶生產(chǎn)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)6、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶3、微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶的方式32.1 酶生物合成過(guò)程 The biosynthesis process of Enzyme1、中心法則- Central Dogma 2、RNA的生物合成- Transcription3、蛋白質(zhì)的生物合成- Translation4、酶生物合成的調(diào)節(jié)- Regula

3、tionGoGoGoGo下一節(jié)下一節(jié)本章目錄4Reverse transcription1、中心法則-Central Dogma 5 Replication Replication 復(fù)制復(fù)制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過(guò)程。 Transcription Transcription 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對(duì)原則將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補(bǔ)的RNA的過(guò)程。 Translation Translation 翻譯翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的AA順序的過(guò)程。 Reverse tran

4、slation Reverse translation 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成DNA的過(guò)程。本節(jié)目錄62、RNA的生物合成(轉(zhuǎn)錄)- Transcription細(xì)胞內(nèi)RNA的生物功能(1) 在某些RNA病毒中，其所含的雙鏈RNA作為遺傳信息的載體。 (2) 在蛋白質(zhì)的生物合成過(guò)程中，各種RNA起著重要的作用。其中，tRNA作為氨基酸載體，并由其上的反密碼子識(shí)別mRNA分子上的密碼子；mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，由其分子上的三聯(lián)體密碼控制蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序；rRNA與蛋白質(zhì)一起組成核糖核蛋白體（核糖體），作為蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。(3) 某些RNA具有

5、生物催化活性，屬于核酸類(lèi)酶，在一定條件下，可以催化有關(guān)的生化反應(yīng)。(4) 各種小分子RNA在分子修飾和代謝調(diào)節(jié)等方面有重要作用。7轉(zhuǎn)錄過(guò)程的特點(diǎn)1 1、轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱(chēng)性轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱(chēng)性：在：在RNARNA的合成中，的合成中，DNADNA的二條鏈中僅有的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱(chēng)性。一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱(chēng)性。反義鏈反義鏈 antisense strandantisense strand（無(wú)意義鏈，負(fù)鏈）：（無(wú)意義鏈，負(fù)鏈）：在在RNARNA的轉(zhuǎn)錄中，的轉(zhuǎn)錄中，用作模板的用作模板的DNADNA鏈稱(chēng)為反義鏈。鏈稱(chēng)為反義鏈。有義鏈有義鏈 coding stran

6、dcoding strand（編碼鏈，正鏈）：（編碼鏈，正鏈）：在在RNARNA的轉(zhuǎn)錄中，不的轉(zhuǎn)錄中，不作為模板的作為模板的DNADNA鏈稱(chēng)為有義鏈。鏈稱(chēng)為有義鏈。2 2、轉(zhuǎn)錄所需酶：、轉(zhuǎn)錄所需酶：依賴(lài)依賴(lài)DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶又稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄酶，是以又稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄酶，是以DNADNA為模板的一類(lèi)為模板的一類(lèi)RNARNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，聚合酶。在原核生物和真核生物中，轉(zhuǎn)錄酶有所不同。原核生物的轉(zhuǎn)錄酶比較簡(jiǎn)單，由轉(zhuǎn)錄酶有所不同。原核生物的轉(zhuǎn)錄酶比較簡(jiǎn)單，由1 1種種RNARNA聚合酶催化所有聚合酶催化所有RNARNA的生物合成。而在真核生物中的生物合成。而在真核生物中RN

7、ARNA聚合酶有聚合酶有3 3種種，分別為，分別為RNARNA聚合酶聚合酶、RNARNA聚合酶聚合酶和和RNARNA聚合酶聚合酶，它們都屬于寡聚酶，酶的亞基數(shù)目為，它們都屬于寡聚酶，酶的亞基數(shù)目為4 41010個(gè)，亞基種類(lèi)有個(gè)，亞基種類(lèi)有4 46 6種。種。 8轉(zhuǎn)錄過(guò)程 起始位點(diǎn)的識(shí)別起始位點(diǎn)的識(shí)別 recognitionrecognition 轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始 initiationinitiation 鏈的延伸鏈的延伸 elongationelongation 轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止 terminationtermination 轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后加工 modificationmodificatio

8、n9The E. coli RNA polymerase holoenzyme consists ofsix subunits: Possible catalytic subunitsPromoterspecificity10本節(jié)目錄113、蛋白質(zhì)的合成(翻譯)-Translation翻譯翻譯: : 以以RNARNA中中mRNAmRNA為模板為模板, ,按照其按照其 核苷酸順序所組成的密碼指核苷酸順序所組成的密碼指 導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成的過(guò)程導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成的過(guò)程. .mRNAmRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯翻譯 各種信息各種信息 各種蛋白質(zhì)各種蛋白質(zhì)（核苷酸排列順序）（核苷酸排列順序） （氨基酸排列順序）（

9、氨基酸排列順序）12蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素-mRNA(模板，template) mRNAmRNA是帶有是帶有DNADNA遺傳信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的直接模板。遺傳信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的直接模板。 以以mRNAmRNA為模板為模板, ,合成一定結(jié)構(gòu)的多肽鏈的過(guò)程合成一定結(jié)構(gòu)的多肽鏈的過(guò)程( (翻譯翻譯) )，就，就是將是將mRNAmRNA分子中的核苷酸排列順序轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)分子中分子中的核苷酸排列順序轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)分子中的氨基酸排列順序。的氨基酸排列順序。13蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素-遺傳密碼，nucleotide triplet codon mRNAmRNA分子中分子中, ,每三個(gè)相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表

10、某種每三個(gè)相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表某種氨基酸或其它信息，稱(chēng)為氨基酸或其它信息，稱(chēng)為密碼子密碼子或或三聯(lián)密碼三聯(lián)密碼。 四種核苷酸編成三聯(lián)體可形成四種核苷酸編成三聯(lián)體可形成4 43 3個(gè)即個(gè)即6464個(gè)密碼子。其中：個(gè)密碼子。其中： 一個(gè)起始密碼一個(gè)起始密碼: : AUGAUG 三個(gè)終止密碼三個(gè)終止密碼: : UAA UGA UAGUAA UGA UAG 多數(shù)氨基酸擁有多數(shù)氨基酸擁有 2-42-4個(gè)密碼個(gè)密碼141516蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素- 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (transporter) tRNAtRNA是氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)工具，攜帶活化的氨基酸到核蛋白體。是氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)工具，攜帶活化的氨基酸到核蛋白體

11、。 tRNAtRNA有特異性，至少有有特異性，至少有2020種以上。每種種以上。每種tRNAtRNA的反密碼環(huán)頂端的反密碼環(huán)頂端均有由三個(gè)核苷酸組成的均有由三個(gè)核苷酸組成的反密碼反密碼，能與，能與mRNAmRNA上相應(yīng)的密碼互上相應(yīng)的密碼互補(bǔ)結(jié)合。補(bǔ)結(jié)合。17酪酪555533AUGGUU UAC ACA酪氨酰酪氨酰- tRNA反密碼反密碼mRNA密碼密碼(codon)(codon)與反密碼與反密碼(anticodon)(anticodon)的堿基配對(duì)的堿基配對(duì)18蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素-核糖體，ribosome 核糖體（或稱(chēng)核糖核蛋白體）由蛋白質(zhì)和rRNA組成。是存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的微小顆粒。19T

12、he ribosome The ribosome composition of composition of prokaryotic and prokaryotic and eukaryotic celleukaryotic cell沉降系數(shù)就是用來(lái)沉降系數(shù)就是用來(lái)表示生物組織成分表示生物組織成分在離心力場(chǎng)下沉淀在離心力場(chǎng)下沉淀下來(lái)的速度大小，下來(lái)的速度大小，沉降系數(shù)越大，越沉降系數(shù)越大，越先沉降先沉降20蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素- -其他因子和酶其他因子和酶 其他輔助因子其他輔助因子 工具酶工具酶21蛋白質(zhì)的合成過(guò)程 肽鏈合成的起始肽鏈合成的起始 initiation 肽鏈合

13、成的延伸肽鏈合成的延伸 elongation 肽鏈合成的終止與釋放肽鏈合成的終止與釋放 termination and release 合成多肽的輸送和加工合成多肽的輸送和加工 transport and modification 蛋白質(zhì)分子的折疊蛋白質(zhì)分子的折疊 folding22氨基酸活化生成氨酰-tRNA 23原核生物肽鏈合成的起始階段是在GTP和起始因子（Initiation Factor）的參與下，核糖體30 S亞基，fMet- tRNAF ，mRNA和50 S 亞基結(jié)合，組成起始復(fù)合物的過(guò)程。主要包括5個(gè)步驟：（1）30 S亞基與起始因子IF3 結(jié)合；（2）30 S亞基與mRNA結(jié)

14、合，形成30 S-IF3-mRNA復(fù)合物；（3）fMet- tRNAF 與起始因子IF2以及GTP結(jié)合，生成fMet- tRNAF -IF2-GTP；（4）在起始因子IF1的參與下，fMet- tRNAF-IF2-GTP與30 S-IF3-mRNA結(jié)合生成30 S起始復(fù)合物。在此30 S起始復(fù)合物中，fMet- tRNAF上的反密碼子正好與mRNA上的起始密碼子AUG結(jié)合；（5）50 S亞基與上述30 S起始復(fù)合物結(jié)合，形成完整的70 S核糖體。同時(shí)放出IF1，IF2，IF3 ，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70 S核糖體形成時(shí)，fMet- tRNAF 位于70 S核糖體的“P”位（肽酰

15、基位），而它的“A”位（氨?；唬┦强瘴?。 蛋白質(zhì)合成起始24進(jìn)進(jìn)位位轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)位位成肽成肽25合成終止26高效率的蛋白質(zhì)合成體系27 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)如何形成？ 功能與結(jié)構(gòu)如何統(tǒng)一？ 體外、體內(nèi)的結(jié)構(gòu)如何變化？ 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)及蛋白質(zhì)工程的需要蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)及蛋白質(zhì)工程的需要 越來(lái)越多的基因工程產(chǎn)物需要復(fù)性復(fù)活越來(lái)越多的基因工程產(chǎn)物需要復(fù)性復(fù)活, , 要求蛋白質(zhì)折疊要求蛋白質(zhì)折疊的理論及技術(shù)的指導(dǎo)的理論及技術(shù)的指導(dǎo)?；蚬こ讨亟M蛋白類(lèi)產(chǎn)物必須要形成正確的折疊才能表現(xiàn)出功能和活性。蛋白質(zhì)的折疊本節(jié)目錄28A BEX底物水平底物水平的調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)酶水平酶水平的調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié) 酶活性的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)酶含量的

16、調(diào)節(jié)酶含量的調(diào)節(jié)酶的定位調(diào)節(jié)酶的定位調(diào)節(jié)輔助因輔助因子調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期外界環(huán)境變化外界環(huán)境變化酶合成酶合成與分解速度的變化與分解速度的變化（基因表達(dá)調(diào)控）（基因表達(dá)調(diào)控）產(chǎn)物調(diào)節(jié)產(chǎn)物調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酶的調(diào)控模式4、酶生物合成的調(diào)節(jié) (regulation)29n組成型酶組成型酶 在細(xì)胞中的量比較恒定，環(huán)境因素對(duì)這些酶的合成速率在細(xì)胞中的量比較恒定，環(huán)境因素對(duì)這些酶的合成速率影響不大。影響不大。 如如DNADNA聚合酶，聚合酶，RNARNA聚合酶，糖酵解途徑中的各種酶。聚合酶，糖酵解途徑中的各種酶。n適應(yīng)型酶適應(yīng)型酶 在細(xì)胞中的含量變化較大，其合成速率明顯受到環(huán)境因在細(xì)胞

17、中的含量變化較大，其合成速率明顯受到環(huán)境因素的影響。素的影響。n適應(yīng)型的酶的生物合成受到的調(diào)節(jié)控制：轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)適應(yīng)型的酶的生物合成受到的調(diào)節(jié)控制：轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)、翻譯水平的調(diào)節(jié)、翻譯產(chǎn)物節(jié)、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)、翻譯水平的調(diào)節(jié)、翻譯產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)和酶降解的調(diào)節(jié)。的加工調(diào)節(jié)和酶降解的調(diào)節(jié)。4、酶生物合成的調(diào)節(jié) (regulation)30 酶在細(xì)胞內(nèi)的含量取決于酶的合成速度和分解速度。細(xì)胞酶在細(xì)胞內(nèi)的含量取決于酶的合成速度和分解速度。細(xì)胞根據(jù)自身活動(dòng)需要，嚴(yán)格控制細(xì)胞內(nèi)各種酶的合理含量，根據(jù)自身活動(dòng)需要，嚴(yán)格控制細(xì)胞內(nèi)各種酶的合理含量，從而對(duì)各種生物化學(xué)過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。從而對(duì)各

18、種生物化學(xué)過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。 酶濃度調(diào)節(jié)的化學(xué)本質(zhì)是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。在細(xì)胞內(nèi)，所合成的酶的種類(lèi)及數(shù)量是由特殊的基因信息決定的。DNA所攜帶的酶蛋白遺傳信息，需要通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯而合成酶蛋白。在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程都有特定的調(diào)節(jié)控制機(jī)制，其中轉(zhuǎn)錄的調(diào)控占主導(dǎo)地位。因此，基因表達(dá)的基因表達(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行。調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行。31轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)又稱(chēng)基因調(diào)節(jié)理論轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)又稱(chēng)基因調(diào)節(jié)理論與酶的生物合成關(guān)系密切的基因：調(diào)節(jié)基因、啟動(dòng)基因、操縱基因、結(jié)構(gòu)基因。啟動(dòng)基因決定酶的合成能否開(kāi)始，由兩個(gè)位點(diǎn)組成，一個(gè)是RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，另一個(gè)是cAMP與CAP組成的復(fù)合物（cAMP-C

19、AP）的結(jié)合位點(diǎn)。CAP是cAMP受體蛋白或分解代謝物活化劑蛋白。只有cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)基因的位點(diǎn)上時(shí)，RNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動(dòng)基因上的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)錄才有可能開(kāi)始，否則酶就無(wú)法開(kāi)始合成。調(diào)節(jié)基因可以產(chǎn)生一種阻遏蛋白，當(dāng)阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合時(shí)，由于空間排擠作用，RNA聚合酶就無(wú)法結(jié)合到啟動(dòng)基因的位點(diǎn)上，也無(wú)法進(jìn)入到結(jié)構(gòu)基因的位置進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，因而無(wú)法將DNA上的遺傳信息轉(zhuǎn)錄到mRNA分子上，酶的生物合成無(wú)法進(jìn)行。只有當(dāng)阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合，改變結(jié)構(gòu)而不與操縱基因結(jié)合時(shí)，RNA聚合酶才能結(jié)合到啟動(dòng)基因的位點(diǎn)上，才能開(kāi)始酶的生物合成。32 啟動(dòng)基因、操縱基因、結(jié)構(gòu)基因一起組成操縱

20、子。 在原核生物中，操縱子有兩種類(lèi)型，即誘導(dǎo)型和阻遏型。 誘導(dǎo)型操縱子在無(wú)誘導(dǎo)物的情況下，其基因的表達(dá)水平很低或不表達(dá)，只有在有誘導(dǎo)物的情況下，才能轉(zhuǎn)錄生成mRNA，進(jìn)而合成酶 阻遏型操縱子在無(wú)阻遏物的情況下，基因正常表達(dá)，當(dāng)有阻遏物存在時(shí)，轉(zhuǎn)錄受到阻遏。 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)主要有3種模式，分解代謝物阻遏作用、酶合成的誘導(dǎo)作用和酶合成的反饋?zhàn)瓒糇饔?3分解代謝物阻遏作用 某些物質(zhì)（主要指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）經(jīng)過(guò)分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏某些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成的現(xiàn)象 如葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的生物合成，果糖阻遏-淀粉酶的生物合成。 添加一定量的cAMP可以減少或解除分解代謝物阻遏作用。

21、34細(xì)菌乳糖操縱子的作用機(jī)制細(xì)菌乳糖操縱子的作用機(jī)制( (分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏) )調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子操縱操縱基因基因lacZ lacYlacACAPcAMPCAP-cAMPCAP-cAMP復(fù)合物復(fù)合物mRNAmRNA當(dāng)葡萄糖作唯一碳源時(shí)，葡萄糖的降解物對(duì)腺苷酸環(huán)化酶（將當(dāng)葡萄糖作唯一碳源時(shí)，葡萄糖的降解物對(duì)腺苷酸環(huán)化酶（將ATPATP轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變成變成cAMPcAMP ）有抑制作用，則）有抑制作用，則cAMPcAMP的濃度降低，的濃度降低， CAP-CAP-cAMPcAMP復(fù)合物減少，復(fù)合物減少，不能與啟動(dòng)子結(jié)合，故轉(zhuǎn)錄不得進(jìn)行。不能與啟動(dòng)子結(jié)合，故轉(zhuǎn)錄不得進(jìn)行。+-半乳糖苷酶-

22、半乳糖苷透過(guò)酶-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶酶過(guò)去稱(chēng)葡萄糖效應(yīng)過(guò)去稱(chēng)葡萄糖效應(yīng)35酶生物合成的誘導(dǎo)作用酶生物合成的誘導(dǎo)作用酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象Jacob and Monod的工作： 已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶； -半乳糖苷透過(guò)酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實(shí)驗(yàn)： 1.大腸桿菌生長(zhǎng)在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無(wú)上述三種酶合成； 2.大腸桿菌生長(zhǎng)在唯一碳源乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；當(dāng)換成葡萄糖培養(yǎng)基時(shí)，三種酶基本消失； 3.表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：需要時(shí)才合成。 本世紀(jì)三十年代，本世紀(jì)三十年代，H.KarstromH.Karstrom在對(duì)糖代謝過(guò)程中的某些酶在對(duì)糖代謝過(guò)程中的某些酶的合成

23、進(jìn)行研究時(shí)提出：的合成進(jìn)行研究時(shí)提出：誘導(dǎo)酶與組成酶誘導(dǎo)酶與組成酶加入某種物質(zhì)使酶的生物合成開(kāi)始或加速進(jìn)行的過(guò)程，叫做加入某種物質(zhì)使酶的生物合成開(kāi)始或加速進(jìn)行的過(guò)程，叫做酶合成的誘導(dǎo)酶合成的誘導(dǎo)。能誘導(dǎo)酶合成的物質(zhì)叫。能誘導(dǎo)酶合成的物質(zhì)叫誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物。被誘導(dǎo)合成。被誘導(dǎo)合成的酶叫的酶叫誘導(dǎo)酶誘導(dǎo)酶。36乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)無(wú)誘導(dǎo)物存在時(shí)，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白（無(wú)誘導(dǎo)物存在時(shí)，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白（lac repressor）與操縱）與操縱基因（基因（Olac）的結(jié)合力強(qiáng)，結(jié)構(gòu)基因無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，酶的生物合成受阻。）的結(jié)合力強(qiáng)，結(jié)構(gòu)基因無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，酶的生物合成受阻。37誘導(dǎo)機(jī)制誘

24、導(dǎo)機(jī)制當(dāng)培養(yǎng)基中以乳糖為唯一碳源時(shí)，細(xì)胞吸收乳糖變?yōu)閯e乳糖，別乳糖作為誘當(dāng)培養(yǎng)基中以乳糖為唯一碳源時(shí)，細(xì)胞吸收乳糖變?yōu)閯e乳糖，別乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白結(jié)構(gòu)改變，與操縱基因結(jié)合力變?nèi)酰辉賹?dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白結(jié)構(gòu)改變，與操縱基因結(jié)合力變?nèi)?，不再與操縱基因結(jié)合，酶的生物合成可以進(jìn)行。與操縱基因結(jié)合，酶的生物合成可以進(jìn)行。38酶生物合成的阻遏作用酶生物合成的阻遏作用酶合成阻遏的現(xiàn)象Jacob and Monod的工作：實(shí)驗(yàn)： 1.大腸桿菌生長(zhǎng)在無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在； 2.在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低

25、，直至消失。 3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌生長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)原則：不需要就不合成。酶生物合成的阻遏作用酶生物合成的阻遏作用又稱(chēng)為產(chǎn)物阻遏作用，是指酶催化又稱(chēng)為產(chǎn)物阻遏作用，是指酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到足額的現(xiàn)象。能阻遏酶合成的物質(zhì)叫足額的現(xiàn)象。能阻遏酶合成的物質(zhì)叫輔阻遏物輔阻遏物。被輔阻遏。被輔阻遏物作用而停止合成的酶叫物作用而停止合成的酶叫阻遏酶阻遏酶。39調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白在沒(méi)有阻遏物存在時(shí)，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻在沒(méi)有阻遏物存在時(shí)，調(diào)節(jié)基

26、因產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因的親和力弱，不能與操遏蛋白與操縱基因的親和力弱，不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因能夠表達(dá)縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因能夠表達(dá)調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物輔阻遏物trp當(dāng)環(huán)境中色氨酸濃度增加，阻遏物到當(dāng)環(huán)境中色氨酸濃度增加，阻遏物到達(dá)一定濃度時(shí)，阻遏蛋白與阻遏物結(jié)達(dá)一定濃度時(shí)，阻遏蛋白與阻遏物結(jié)合，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與操縱基因合，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)色氨酸操縱子（酶的阻遏）色氨酸操縱子（酶的阻遏） -阻遏物和操縱基因的調(diào)節(jié)阻遏物和操縱基因的調(diào)節(jié)402.2 2.2 常見(jiàn)產(chǎn)酶微生物常見(jiàn)產(chǎn)酶微生物 Commo

27、n microorganism Common microorganism in Enzyme Productionin Enzyme Production基本要求： 發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高； 容易培養(yǎng)和管理； 產(chǎn)酶穩(wěn)定性好，不易變異退化，不易被感染； 利于酶的分離純化； 安全可靠，無(wú)毒性。（非致病菌）： 凡從可食部分或食品加工中傳統(tǒng)使用的微生物生產(chǎn)的酶,安全! 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性實(shí)驗(yàn)。 非常見(jiàn)微生物制取的酶,需做廣泛的毒性實(shí)驗(yàn),包括慢性中毒實(shí)驗(yàn)。41形態(tài)：短桿或長(zhǎng)桿狀，0.51.01.03.0 um，革蘭氏陰性，運(yùn)動(dòng)(周毛)或不運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢，一般無(wú)莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴(kuò)展，

28、光滑，閃光。Escherich屬菌株和大多數(shù)大腸桿菌是無(wú)害，但也有些大腸桿菌是致病的，會(huì)引起腹瀉和尿路感染。大腸桿菌的名聲主要因它易于在實(shí)驗(yàn)室操作、生長(zhǎng)迅速，而且營(yíng)養(yǎng)要求低。應(yīng)用：大腸桿菌能作為宿主供大量的細(xì)菌病毒生長(zhǎng)繁殖大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌基因工程的宿主菌工業(yè)上生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和 制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等42菌體從橢圓至桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成鏈，革蘭氏陰性，運(yùn)動(dòng)（周毛）或不運(yùn)動(dòng)，不生芽孢。好氣。含糖、乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。應(yīng)用：有機(jī)酸(食醋等）葡萄糖異構(gòu)酶(高果糖漿 )山梨糖 (維C中間體） 43直狀、近直狀的桿菌，周生或側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)莢膜

29、，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生?？莶菅挎邨U菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。44分類(lèi)學(xué)上屬于藻狀菌綱，毛霉目，根霉屬。 根霉因有假根（根霉因有假根（RhizoidRhizoid）而得名）而得名（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，并吸收營(yíng)養(yǎng)）。并吸收營(yíng)養(yǎng)）。分布于土壤、空氣中，常見(jiàn)于淀粉分布于土壤、空氣中，常見(jiàn)于淀粉食品上，可引起霉腐變質(zhì)和水果、食品上，可引起霉腐變質(zhì)和水果、蔬菜的腐爛。蔬菜的腐爛。代表種：代表種：米根霉（米根霉（R.oryzae)R.oryzae)黑根黑根霉霉(R.nigrican)(R.nigri

30、can)等。等。應(yīng)用：應(yīng)用：根霉能產(chǎn)生一些酶類(lèi)，如淀根霉能產(chǎn)生一些酶類(lèi)，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產(chǎn)粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產(chǎn)這些酶類(lèi)的菌種。這些酶類(lèi)的菌種。在釀酒工業(yè)上常在釀酒工業(yè)上常用做糖化菌。有些根霉還能產(chǎn)生乳用做糖化菌。有些根霉還能產(chǎn)生乳酸、延胡索酸等有機(jī)酸。酸、延胡索酸等有機(jī)酸。45分類(lèi)：多數(shù)屬于子囊菌亞門(mén)，分類(lèi)：多數(shù)屬于子囊菌亞門(mén)，少數(shù)屬于半知菌亞門(mén)。少數(shù)屬于半知菌亞門(mén)。分布：廣泛分布于土壤、空氣分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質(zhì)，有的可產(chǎn)和果蔬的霉腐變質(zhì)，有的可產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素。生致癌性的黃曲霉毒素。代表

31、種：代表種：黑曲霉黑曲霉Asp. NigerAsp. Niger、黃曲霉黃曲霉Asp.flavusAsp.flavus應(yīng)用：應(yīng)用：是制醬、釀酒、制醋的是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產(chǎn)有機(jī)酸（如檸檬酸、種。生產(chǎn)有機(jī)酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農(nóng)業(yè)上用作生葡萄糖酸等）。農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種。產(chǎn)糖化飼料的菌種。回本節(jié)46固體發(fā)酵固體發(fā)酵液體發(fā)酵液體發(fā)酵2.3 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶的方式微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶的方式47固體發(fā)酵固體發(fā)酵表面培養(yǎng)表面培養(yǎng)或或曲式培養(yǎng)曲式培養(yǎng)以麩皮、以麩皮、米糠等為米糠等為

32、基本原料，基本原料，加入適加入適量的無(wú)機(jī)量的無(wú)機(jī)鹽和水作鹽和水作為培養(yǎng)基為培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶進(jìn)行產(chǎn)酶微生物菌微生物菌種培養(yǎng)的種培養(yǎng)的一種培養(yǎng)一種培養(yǎng)技術(shù)技術(shù)淺盤(pán)培養(yǎng)淺盤(pán)培養(yǎng)轉(zhuǎn)桶培養(yǎng)轉(zhuǎn)桶培養(yǎng)多用通風(fēng)式多用通風(fēng)式厚層培養(yǎng)厚層培養(yǎng)固體發(fā)酵技術(shù)原理48設(shè)備簡(jiǎn)單，便于推廣，特別設(shè)備簡(jiǎn)單，便于推廣，特別適合于霉菌的培養(yǎng)和產(chǎn)酶適合于霉菌的培養(yǎng)和產(chǎn)酶發(fā)酵條件不易控制、物料發(fā)酵條件不易控制、物料利用不完全、勞動(dòng)強(qiáng)度大、利用不完全、勞動(dòng)強(qiáng)度大、容易染菌等容易染菌等優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)不適于不適于胞內(nèi)酶胞內(nèi)酶的生產(chǎn)的生產(chǎn)49液體深層發(fā)酵液體深層發(fā)酵浸沒(méi)式發(fā)酵浸沒(méi)式發(fā)酵利用液體利用液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行的

33、內(nèi)進(jìn)行的一種攪拌一種攪拌通氣培養(yǎng)通氣培養(yǎng)方式方式酶制劑生產(chǎn)的酶制劑生產(chǎn)的主要培養(yǎng)方式主要培養(yǎng)方式液體發(fā)酵法液體發(fā)酵法50工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的微生物酶和它們的某些來(lái)源酶酶產(chǎn)酶微生物產(chǎn)酶微生物用途用途-淀粉酶淀粉酶枯草芽胞桿菌，枯草芽胞桿菌， 地衣芽胞地衣芽胞桿菌，桿菌， 米曲霉米曲霉淀粉液化，織物退漿，消化助劑，淀粉液化，織物退漿，消化助劑，加酶洗滌劑加酶洗滌劑葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶米曲霉，黑曲霉，米根霉米曲霉，黑曲霉，米根霉制造葡萄糖，發(fā)酵、釀酒等工業(yè)的制造葡萄糖，發(fā)酵、釀酒等工業(yè)的淀粉水解糖淀粉水解糖中性蛋白酶中性蛋白酶枯草芽胞桿菌，米曲霉枯草芽胞桿菌，米曲霉皮革、毛皮加工，食品加工，調(diào)味皮革、

34、毛皮加工，食品加工，調(diào)味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清品制造、助消化、消炎、啤酒澄清堿性蛋白酶堿性蛋白酶地衣芽胞桿菌地衣芽胞桿菌加酶洗滌劑加酶洗滌劑植酸酶植酸酶黑曲霉，畢赤酵母工程菌株黑曲霉，畢赤酵母工程菌株飼料添加劑飼料添加劑轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化酶啤酒酵母、假絲酵母啤酒酵母、假絲酵母制造轉(zhuǎn)化糖制造轉(zhuǎn)化糖凝乳酶凝乳酶米赫毛霉、大腸桿菌和真菌生產(chǎn)的重組酶米赫毛霉、大腸桿菌和真菌生產(chǎn)的重組酶制造乳酪制造乳酪脂肪酶脂肪酶曲霉、根霉、酵母等曲霉、根霉、酵母等加酶洗滌劑，油脂加工，生物化加酶洗滌劑，油脂加工，生物化工工葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶青霉、曲霉青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，測(cè)定葡萄食品去氧、除葡萄糖，測(cè)定

35、葡萄糖糖葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶凝結(jié)芽胞桿菌，白色鏈霉菌凝結(jié)芽胞桿菌，白色鏈霉菌生產(chǎn)果葡糖漿生產(chǎn)果葡糖漿青霉素酰化酶青霉素?；讣?xì)菌、霉菌、放線菌細(xì)菌、霉菌、放線菌制造制造6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸纖維素酶纖維素酶里氏木霉、黑曲霉里氏木霉、黑曲霉水洗布生產(chǎn)，飼料添加劑，消化植物細(xì)胞壁水洗布生產(chǎn)，飼料添加劑，消化植物細(xì)胞壁半纖維素酶半纖維素酶木霉、曲霉、根霉木霉、曲霉、根霉飼料添加劑，消化植物細(xì)胞壁，低聚木糖生產(chǎn)飼料添加劑，消化植物細(xì)胞壁，低聚木糖生產(chǎn)-葡聚糖酶葡聚糖酶枯草芽胞桿菌，黑曲霉枯草芽胞桿菌，黑曲霉啤酒釀造，飼料添加劑啤酒釀造，飼料添加劑異淀粉酶異淀粉酶產(chǎn)氣克雷伯氏菌，芽孢桿菌產(chǎn)氣克

36、雷伯氏菌，芽孢桿菌淀粉加工淀粉加工乳糖酶乳糖酶乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉霉乳品工業(yè)（處理牛乳和乳清）乳品工業(yè)（處理牛乳和乳清）果膠酶果膠酶曲霉、歐文氏菌曲霉、歐文氏菌水果加工，果汁、果酒澄清，麻類(lèi)纖維脫膠水果加工，果汁、果酒澄清，麻類(lèi)纖維脫膠52酶酶無(wú)菌空氣無(wú)菌空氣預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞保藏細(xì)胞保藏細(xì)胞細(xì)胞活化細(xì)胞活化培養(yǎng)基培養(yǎng)基固定化原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體發(fā)酵發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)分離純化分離純化工藝流程工藝流程 2.4 酶的發(fā)酵工藝條件與控制酶的發(fā)酵工藝條件與控制53一、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)一、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)1、生產(chǎn)菌種的來(lái)源、

37、生產(chǎn)菌種的來(lái)源（1）購(gòu)買(mǎi)或篩選向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株。 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）； 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC，又稱(chēng)武大保藏中心）。 中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心（ACCC）； 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC） 美國(guó)典型微生物菌種保藏中心（ATCC） 荷蘭微生物菌種保藏中心（CBS） 德國(guó)微生物菌種保藏中心（DSMZ） 英國(guó)國(guó)家典型菌種保藏所（NCTC）54（2）篩選）篩選 由自然界采集樣品，如土壤、水、動(dòng)植物體等，從中進(jìn)由自然界采集樣品，如土壤、水、動(dòng)植物體等，從中進(jìn)行分離篩選行分離篩選 。篩選步驟：樣品的采集：主要是各種富含所需微生物

38、的土壤、水、氣、枯枝爛葉、爛水果等 。初篩：分離產(chǎn)目的酶的菌株 給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進(jìn)而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地把只成為目的菌的菌株分離出來(lái)。55-淀粉酶的篩選蛋白酶的篩選56復(fù)篩：從所得菌株中篩選優(yōu)良株復(fù)篩：從所得菌株中篩選優(yōu)良株 在初篩的基礎(chǔ)上，篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。在初篩的基礎(chǔ)上，篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。高產(chǎn)菌株的選育高產(chǎn)菌株的選育 誘變育種誘變育種 、細(xì)胞雜交、原生質(zhì)體融合育種、細(xì)胞雜交、原生質(zhì)體融合育種 、基因工程育種、基因工程育種 （3）保藏）保藏 常用的保藏方法：斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷凍常用的保藏方法：斜面保藏法、沙土管保藏

39、法、真空冷凍干燥保藏法、低溫保藏法、石蠟油保藏法。干燥保藏法、低溫保藏法、石蠟油保藏法。572、生產(chǎn)種子的制備 生產(chǎn)種子：由原始保藏菌種，經(jīng)過(guò)活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，用于發(fā)酵罐接種的大量菌體。（1）菌種活化）菌種活化 目的：保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定的條件下培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞的生命活動(dòng)能力。 方法：在試管斜面上培養(yǎng)13代。58（2）擴(kuò)大培養(yǎng)）擴(kuò)大培養(yǎng) 目的：活化后的菌種經(jīng)過(guò)一級(jí)至數(shù)級(jí)的擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞。 培養(yǎng)基稱(chēng)為種子培養(yǎng)基。59 方法：分為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和車(chē)間培養(yǎng)兩個(gè)階段。擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)注意的事項(xiàng)：（1）盡量減少傳代次數(shù)，以降低菌種衰退和污染的可能性；

40、（2）培養(yǎng)基成分一般應(yīng)比發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源豐富；（3）培養(yǎng)時(shí)間一般控制在微生物生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，及時(shí)接入下一級(jí)培養(yǎng)或發(fā)酵罐；（4）嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件（pH、溫度、通氣量等），加強(qiáng)培養(yǎng)過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。60二、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分一般包括碳源、氮源，無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等。培養(yǎng)基是指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。611、碳源在酶的生物合成法生產(chǎn)過(guò)程中，首先要從細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求和代謝調(diào)節(jié)方面考慮碳源的選擇；此外還要考慮到原料的來(lái)源是否充裕、價(jià)格是否低廉、對(duì)發(fā)酵工藝條件和酶的分離純化是否影響等因素。不同的細(xì)胞對(duì)各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇

41、合適的碳源。如黑曲霉具有淀粉酶系，可以采用淀粉為碳源，而酵母不能利用淀粉，只能采用蔗糖和葡萄糖等為碳源。62 當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)使用的菌種大都是只能利用有機(jī)碳的異養(yǎng)型微生物。 有機(jī)碳的主要來(lái)源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質(zhì)原料。 此外，以石油產(chǎn)品中1216碳的成分來(lái)作碳源，如以某些嗜石油微生物生產(chǎn)蛋白酶、脂酶，均已獲得成功。632、氮源酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源兩種。 常用的有機(jī)氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚(yú)粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等； 無(wú)機(jī)氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH

42、4)3PO4、尿素等。643、 碳氮比 碳氮比(C/N)指培養(yǎng)基中碳元素的總量與氮元素總量之比。有的采用碳源總量和氮源總量之比。 一般蛋白酶 (包括酸性、中性和堿性蛋白酶) 生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利。 淀粉酶(包括-淀粉酶、糖化酶、-淀粉酶等)生產(chǎn)的碳氮比一般比蛋白酶生產(chǎn)略高。65 在微生物酶生產(chǎn)過(guò)程中，培養(yǎng)基的碳氮比也因培養(yǎng)過(guò)程不同而異。例如種子培養(yǎng)時(shí)，為了適應(yīng)菌體生長(zhǎng)繁殖的需要，種子培養(yǎng)基的碳氮比一般要比發(fā)酵培養(yǎng)基低些。 發(fā)酵時(shí)，不同發(fā)酵階段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草桿菌BF-7658生產(chǎn)-淀粉酶的發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵前期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)降低，以利菌體生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵中后期

43、要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)提高，以促進(jìn)淀粉酶的生成。664、無(wú)機(jī)鹽 不同無(wú)機(jī)鹽在細(xì)胞的生命活動(dòng)中作用不同，如主要組成元素（磷和硫），酶分子的組成元素（磷、硫、鋅、鈣），酶的激活劑（鉀、鎂、鋅、銅、鐵、錳、鈣、鉬、鈷、碘等），調(diào)節(jié)pH、氧化還原電位和滲透壓（鈉、鉀、鈣、磷、氯等） 根據(jù)細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)元素需要量的不同，無(wú)機(jī)元素分為大量元素和微量元素兩大類(lèi)。大量元素：磷、硫、鉀、鈣、鎂、氯等；微量元素：銅、錳、鋅、鉬、鈷、溴、碘等675、 生長(zhǎng)因子 微生物還需一些微量的像維生素一類(lèi)的物質(zhì)，才能正常生長(zhǎng)發(fā)育，這類(lèi)物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)生長(zhǎng)因子(或生長(zhǎng)素)。其中包括某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等。 酶制劑生產(chǎn)中所需的生長(zhǎng)因

44、子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。玉米漿中一般含有生長(zhǎng)素32128mg/mL。68三、液體深層發(fā)酵的工藝控制 酶的發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵效果除了受到菌種產(chǎn)酶性能的影響外，還受到發(fā)酵溫度、pH、溶氧量等條件的影響。691、溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨著菌種和酶的性質(zhì)不同而異，生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度往往不一致。 一般細(xì)菌為37 ，霉菌和放線菌為2830 ，一些嗜熱微生物需在4050 下生長(zhǎng)繁殖，如紅曲霉生長(zhǎng)溫度3537，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為3740 。70在酶生產(chǎn)中，為了有利于菌體生長(zhǎng)和酶的合成，也有進(jìn)行變溫生產(chǎn)的。例如以枯草桿菌ASl.

45、398進(jìn)行中性蛋白酶生產(chǎn)時(shí)，培養(yǎng)溫度必須從31 逐漸升溫至40 ，然后再降溫到31進(jìn)行培養(yǎng)，蛋白酶產(chǎn)量比不升溫者高66%。71 發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度的變化而變化的。 細(xì)胞的新陳代謝釋放能量, 通風(fēng)攪拌導(dǎo)致發(fā)酵液升溫。同時(shí)由于熱量的不斷擴(kuò)散，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的溫度不斷降低。兩者決定培養(yǎng)基的溫度。 溫度調(diào)控一般采用熱水升溫、冷水降溫的方法。 發(fā)酵罐或其他生物反應(yīng)器均設(shè)計(jì)有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等。722、pH對(duì)產(chǎn)酶的影響不同的細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的最適pH有所不同。 細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH與生長(zhǎng)最適pH往往有所不同。細(xì)胞生產(chǎn)某種酶的最適pH通

46、常接近于該酶催化反應(yīng)的最適pH。73 培養(yǎng)基的pH 隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝產(chǎn)物的積累，往往會(huì)發(fā)生變化。 一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，由于糖代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。 控制pH的方法：改變培養(yǎng)基的組分和比列；使用緩沖液維持一定的pH；使用酸堿調(diào)節(jié)pH等。743、溶解氧對(duì)產(chǎn)酶的影響細(xì)胞必須獲得充足的氧氣，使從培養(yǎng)基中獲得的能源物質(zhì)（一般是指各種碳源）經(jīng)過(guò)有氧降解而生成大量的細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖和酶的生物合成過(guò)程需要大量的能量ATP。75在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞一般只能吸收和利用溶解氧。在發(fā)酵過(guò)程中必須不斷供給氧（一般通過(guò)供給無(wú)菌空氣

47、來(lái)實(shí)現(xiàn)），使培養(yǎng)基中的溶解氧保持在一定的水平。細(xì)胞對(duì)溶解氧的需要量與細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度及培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度密切相關(guān)?？梢杂煤难跛俾蔏O2表示： KO2 = QO2 Cc 76氧的溶解速度又稱(chēng)為溶氧速率或溶氧系數(shù)，以Kd表示。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時(shí)間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質(zhì)等有密切關(guān)系。當(dāng)溶氧速率和耗氧速率相等時(shí)，即：K02 =Kd 的條件下，培養(yǎng)液中的溶解氧的量保持恒定，可以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶的需要。77調(diào)節(jié)溶解氧的方法主要有： 調(diào)節(jié)通氣量 調(diào)節(jié)氧的分壓 調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間 調(diào)節(jié)氣液接觸面積 改變培養(yǎng)液的性質(zhì)78 對(duì)于好氣性微生物的深層發(fā)酵，除了需要通氣外，還需要攪拌。攪拌

48、有利于熱交換、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周?chē)拇x產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時(shí)可打破空氣氣泡，從而提高溶氧量，增加空氣利用。但攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產(chǎn)生剪切力，易使細(xì)胞受損。同時(shí)攪拌也帶來(lái)一定機(jī)械熱，易使發(fā)酵液溫度發(fā)生變化。攪拌速度還與發(fā)酵液黏度有關(guān)。4、攪拌的影響795、泡沫的影響 消泡措施：一般除了機(jī)械消泡外，還可利用消泡劑。 理想的消泡劑，其表面相互作用力應(yīng)低，而且應(yīng)難溶于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。 消泡劑主要是一些天然的礦物油類(lèi)、醇類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、胺類(lèi)、酰胺類(lèi)、醚類(lèi)、硫酸酯類(lèi)、金屬皂類(lèi)、聚硅氧烷和聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。我國(guó)常用聚氧丙烯甘

49、油醚或泡敵（聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘油醚）。80四、提高酶產(chǎn)量的措施1、添加誘導(dǎo)物、添加誘導(dǎo)物 誘導(dǎo)物一般可以分為3類(lèi):酶的作用底物，酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物和作用底物的類(lèi)似物。 2、控制阻遏物的濃度、控制阻遏物的濃度阻遏作用根據(jù)其作用機(jī)理的不同，可以分為產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。 81控制阻遏物的濃度是解除阻遏、提高酶產(chǎn)量的有效措施。分解代謝物阻遏作用：控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度，或采用其他較難利用的碳源，如淀粉等，或者采用補(bǔ)料、分次流加碳源等方法，控制碳源的濃度在較低的水平。此外，在分解代謝物阻遏存在的情況下，添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP），可以解除或減少分解代謝物阻遏作用。末端產(chǎn)物

50、阻遏的酶，可以通過(guò)控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除。823、添加表面活性劑、添加表面活性劑 表面活性劑可以與細(xì)胞膜相互作用，增加細(xì)胞的透過(guò)性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。 表面活性劑離子型和非離子型兩大類(lèi)。其中，離子型表面活性劑又可以分為陽(yáng)離子型、陰離子型和兩性離子型3種。 將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓（Triton）等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加。由于離子型表面活性劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如新潔而滅等）是消毒劑，對(duì)細(xì)胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。 834、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑

51、產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶、但是作用機(jī)理未闡明清楚的物質(zhì)。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，添加適宜的產(chǎn)酶促進(jìn)劑，往往可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高120倍； 842.4 2.4 酶生產(chǎn)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)酶生產(chǎn)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)1、酶生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)2、酶生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)3、酶生產(chǎn)過(guò)程中基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)85酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué) 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)速率、產(chǎn)物生成速率、基質(zhì)消耗速率以及環(huán)境因素對(duì)這些速率的影響規(guī)律的學(xué)科。 包括細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)和基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)861 1、酶生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、酶生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞生

52、長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) 細(xì)胞在控制一定條件的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的過(guò)程中,其生長(zhǎng)速度受到細(xì)胞內(nèi)外各種因素的影響,變化比較復(fù)雜，情況各不相同。 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)主要研究細(xì)胞生長(zhǎng)速度以及外界環(huán)境因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度影響的規(guī)律。KS 為莫諾德常數(shù)，為莫諾德常數(shù)， 是指比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率一半時(shí)的限制性基質(zhì)濃度。是指比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率一半時(shí)的限制性基質(zhì)濃度。1950年， 法國(guó)的莫諾德（Monod）首先提出了表述微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)方程。他認(rèn)為， 在培養(yǎng)過(guò)程中， 細(xì)胞生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度成正比：XdtdXRx假設(shè)培養(yǎng)基中只有一種限制性基質(zhì)，而不存在其他生長(zhǎng)限制因素時(shí)，為這種限制性基質(zhì)濃度的函數(shù)。SKsSXdtd

53、Xm187莫諾德方程是基本的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程。在發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化以及發(fā)酵莫諾德方程是基本的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程。在發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化以及發(fā)酵過(guò)程控制方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。不少學(xué)者從不同的情況出發(fā)或運(yùn)過(guò)程控制方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。不少學(xué)者從不同的情況出發(fā)或運(yùn)用不同的方法，對(duì)莫諾德方程進(jìn)行了修正，得出了適用于不同情況的用不同的方法，對(duì)莫諾德方程進(jìn)行了修正，得出了適用于不同情況的各種動(dòng)力學(xué)模型。各種動(dòng)力學(xué)模型。連續(xù)培養(yǎng)時(shí)的方程變化形式連續(xù)全混流生物反應(yīng)器進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵的過(guò)程中，連續(xù)不斷流加培養(yǎng)液并連續(xù)排出相同體積的發(fā)酵液。在穩(wěn)態(tài)時(shí)，游離細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)可以表達(dá)為：D為稀釋率，指單位時(shí)間內(nèi)，流加的培養(yǎng)

54、液的與發(fā)酵容器中發(fā)酵液體積之比，一般以/h為單位。882 2、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué) 產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)主要研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)酶速率的影細(xì)胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律響規(guī)律。產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)的研究可以從整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)著眼，研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速率及其影響因素，這稱(chēng)為宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)或這稱(chēng)為非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)。也可以從細(xì)胞內(nèi)部著眼，研究細(xì)胞中酶合成速率及其影響因素，這謂之微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)或稱(chēng)為結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)。89（1 1）酶生物合成的模式）酶生物合成的模式細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)，細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)， 其生長(zhǎng)過(guò)程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長(zhǎng)期、其生長(zhǎng)過(guò)程一般

55、經(jīng)歷調(diào)整期、生長(zhǎng)期、平衡期和衰退期等平衡期和衰退期等4 4個(gè)階段個(gè)階段 90 根據(jù)根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，可將酶的生物合的關(guān)系，可將酶的生物合成分為成分為3種模式，即：種模式，即： 生長(zhǎng)偶聯(lián)型生長(zhǎng)偶聯(lián)型 ：同步合成型和中期合成型：同步合成型和中期合成型 部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型：延續(xù)合成型：延續(xù)合成型 非生長(zhǎng)偶聯(lián)型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型 ： 滯后合成型滯后合成型91同步合成型同步合成型 酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行的一種酶生物合成模式。該類(lèi)型酶的生物合成速度與細(xì)胞生長(zhǎng)速度緊密聯(lián)系， 又稱(chēng)為生長(zhǎng)偶聯(lián)型生長(zhǎng)偶聯(lián)型。 屬于該合成型的酶，其生物合成伴隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開(kāi)始；在

56、細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期時(shí)，酶大量生成；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨著停止。 大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照此種模式進(jìn)行生物合成。此種模式進(jìn)行生物合成。 例如米曲霉在含有單寧或者沒(méi)食子酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在單寧或沒(méi)食子酸的誘導(dǎo)作用下，合成單寧酶（tanase EC3.1.1.20）。 細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細(xì)胞濃度 活細(xì)胞濃度胞外酶濃度 胞內(nèi)酶濃度92延續(xù)合成型延續(xù)合成型 酶的生物合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開(kāi)始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶的生物合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開(kāi)始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長(zhǎng)時(shí)間。酶還可以延續(xù)合成一段較長(zhǎng)時(shí)間。 屬于該類(lèi)型的酶可以是組成酶，也可以是誘導(dǎo)酶。例如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。 細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度