骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植及丹參酮IIA治療糖尿病伴缺血性心臟病的療

1、骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植及丹參酮IIA治療糖尿病伴缺血性心臟病的療效及機(jī)制探討    內(nèi)容導(dǎo)讀：是源于心血管疾病。目前對(duì)于糖尿病伴缺血性心臟病的治療措施主要有經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)、藥物治療等。固然現(xiàn)有方法能夠迅速開通血管,但有很多患者仍不可避免的發(fā)生心力衰竭,使得糖尿病伴缺血性心臟病的治療碰到了難以突破的瓶頸。干細(xì)胞移植為缺血性心臟病的患者帶來了希望,很多研究表明,骨 研究背景糖尿病與心血管疾病的關(guān)系十分密切,2001年美國國家膽固醇教育計(jì)劃成人治療指南(ATPIII)將糖尿病列為冠心病等危癥。中國流行病學(xué)調(diào)查研究顯示

2、,糖尿病住院患者中冠心病的發(fā)病率為52.9。糖尿病患者的心源性死亡率比非糖尿病患者高2-4倍,糖尿病引起的死亡中65是源于心血管疾病。目前對(duì)于糖尿病伴缺血性心臟病的治療措施主要有經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)、藥物治療等。固然現(xiàn)有方法能夠迅速開通血管,但有很多患者仍不可避免的發(fā)生心力衰竭,使得糖尿病伴缺血性心臟病的治療碰到了難以突破的瓶頸。干細(xì)胞移植為缺血性心臟病的患者帶來了希望,很多研究表明,骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)移植可明顯改善患者左室功能,逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu),延緩心力衰竭的發(fā)展進(jìn)程。因此,本研究的第一部分?jǐn)M觀察骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植輔助PCI術(shù)治療糖尿病伴急性心

3、肌梗死的安全性和療效。目前對(duì)于糖尿病伴缺血性心臟病的治療藥物種類繁多,包括阿司匹林、氯比格雷、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、他汀類調(diào)脂藥等。我們的前期研究表明,丹參酮IIA這一中藥提取物,對(duì)于缺血性心臟病療效確切,并具有潛在的抗心律變態(tài)|教育教學(xué)論文|作用。那么丹參酮IIA對(duì)于糖尿病伴缺血性心臟病的療效如何?其發(fā)揮作用的分子機(jī)制是什么?目前尚不清楚。眾所周知,PI3K/Akt途徑是一條經(jīng)典的細(xì)胞生存信號(hào)途徑,該信號(hào)途徑激活后,可降低高血糖引起的心肌細(xì)胞凋亡增多,抑制心肌內(nèi)炎癥反應(yīng),從而降低心肌損傷。因此,本研究的第二部分?jǐn)M觀察丹參酮IIA對(duì)于糖尿病伴缺血性心臟病的保護(hù)作用;該作用是否與PI3K/Ak

4、t途徑相關(guān)。研究目的1.觀察骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)移植對(duì)于糖尿病伴ST段抬高急性心肌梗死的安全性和療效;2.構(gòu)建糖尿病大鼠缺血再灌注損傷模型,觀察丹參酮A對(duì)于糖尿病大鼠心肌梗死面積、左室功能、心肌細(xì)胞凋亡的影響;3.闡明丹參酮A對(duì)于同體積的生理鹽水。1.5細(xì)胞移植后1月、3月、1年記錄患者ECG,UCG,SPECT結(jié)果和血清學(xué)指標(biāo)。細(xì)胞移植后6月、4年時(shí),除上述各項(xiàng)指標(biāo)外,加做冠狀動(dòng)脈造影檢查。隨訪期間記錄主要心臟不良事件(MACE)發(fā)生情況,包括心源性死亡、非致死性心肌梗死、靶血管重建等。2.丹參酮IIA對(duì)糖尿病大鼠心臟缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制2.1選取體重1 糖尿病大鼠缺血再灌注

5、損傷的保護(hù)作用是否與PI3K/Akt信號(hào)途徑相關(guān)。研究方法1.骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)移植對(duì)于糖尿病伴ST段抬高急性心肌梗死的安全性和療效研究1.1選擇罪犯血管為第2對(duì)角支近端LAD病變的STEMI患者,發(fā)病12h內(nèi)行PCI治療,符合納入排除標(biāo)準(zhǔn),簽署知情同意書的患者納入試驗(yàn),隨機(jī)分為BMMNC組和對(duì)照組。共納入86例患者,其中BMMNC組41例,對(duì)照組45例。BMMNC組糖尿病患者n=10,對(duì)照組糖尿病患者n=12。1.2所有患者給予缺血性心臟病常規(guī)用藥,根據(jù)是否患有糖尿病,給予血糖控制治療。記錄具體病史、各項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)、心電圖(ECG)、超聲心動(dòng)圖(UCG)、核素心肌灌注掃描(SPEC

6、T)結(jié)果。1.3PCI術(shù)后7天在局部麻醉下從患者髂前上嵴抽取骨髓液40ml,密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)。將分離的BMMNC重懸于10ml肝素化生理鹽水中,細(xì)胞數(shù)量約為5±1.2×108/ml。細(xì)胞活力為96±3.2,CD34 陽性細(xì)胞數(shù)為1.8±0.6。1.4冠脈內(nèi)注射BMMNC,將10ml細(xì)胞懸液分4次注射入罪犯血管內(nèi),對(duì)照組注射同體積的生理鹽水。1.5細(xì)胞移植后1月、3月、1年記錄患者ECG,UCG,SPECT結(jié)果和血清學(xué)指標(biāo)。細(xì)胞移植后6月、4年時(shí),除上述各項(xiàng)指標(biāo)外,加做冠狀動(dòng)脈造影檢查。隨訪期間記錄主要心臟不良事件(MACE)

7、發(fā)生情況,包括心源性死亡、非致死性心肌梗死、靶血管重建等。2.丹參酮IIA對(duì)糖尿病大鼠心臟缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制2.1選取體重180-220g雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,腹腔注射STZ(50mg/kg),以2次隨機(jī)血糖16.7mmol/L以為|教育論文網(wǎng)|糖尿病模型造模成功。2.2注射STZ成功建模后7w,丹參酮IIA組腹腔注射TSN(5mg/kg),1/d,連續(xù)7d;Wormannin組每 次TSN注射前10min,尾靜脈注射PI3K特異性抑制劑Wormannin(16g/kg),假手術(shù)組和缺血再灌組給予同體積生理鹽水。2.3STZ注射后8w結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支(

8、LAD),構(gòu)建缺血再灌注模型,3異氟烷吸入麻醉,缺血30min,再灌注3h或24h。2.4十六道生理記錄儀記錄STZ注射前、STZ注射后7w、缺血再灌注前后血活動(dòng)|教育教學(xué)論文|力學(xué)指標(biāo)(±LVdp/dtmax)。2.5超聲心動(dòng)圖記錄記錄STZ注射前、STZ注射后7w、缺血再灌注前后左室功能指標(biāo)(ESV,EDV,LVEF)。2.6Evansblue與TTC雙染丈量|教學(xué)論文網(wǎng)|缺血區(qū)及梗死區(qū)面積。2.7TUNEL染色及caspase活性檢測觀察心肌細(xì)胞凋亡。2.8Western-Blot檢測Akt,p-Akt(Ser473),NF-B表達(dá)。2.9ELISA檢測炎癥因子TNF-,IL-

9、6表達(dá),髓過氧化酶(MPO)表達(dá)。研究結(jié)果1.骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)移植對(duì)于糖尿病伴ST段抬高急性心肌梗死的安全性和療效1.1BMMNC移植可安全用于ST段抬高急性心肌梗死的輔助治療。MACE事件發(fā)生情況如下:冠狀動(dòng)脈造影提示,對(duì)照組1例(2.2)患者發(fā)生冠脈內(nèi)再狹窄,1例(2.2)患者死亡。BMMNC組1例患者(2.4)發(fā)生急性左心衰。1.2超聲心動(dòng)圖結(jié)果提示,各組患者LVEF均明顯改善,與對(duì)照組比較,BMMNC組的LVEF在6個(gè)月隨訪(0.484±0.5vs0.457±0.6,p=0.001),1年隨訪(0.482±0.7vs0.446±0.6

10、,p0.001)和4年隨訪時(shí)(0.505±0.8vs0.464±0.8,p0.001)改善更為明顯。BMMNC組和對(duì)照組的WMSI在4年隨訪期間均降低,對(duì)照組的WMSI在6個(gè)月隨訪(1.43±0.01vs1.48±0.02,p=0.04),1年隨訪(1.35±0.±1.0,p=0.062)。1.6無論是在細(xì)胞移植組或是對(duì)照組,非糖尿病患者LVEF變化值均高于糖尿病患者LVEF變化值(BMMNC:(9.7±1.0)vs(7.6±0.9),p=0.258;Control(6.7±0.8)vs(3.0±

11、;0.7),p=0.014)。2.丹參酮IIA對(duì)糖尿病大鼠心臟缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制2.1丹參酮IIA改善糖尿病大鼠缺血再灌注后左室功能:血活動(dòng)|教育教學(xué)論文|力學(xué)結(jié)果提 02vs1.41±0.02,p=0.02)和4年隨訪時(shí)(1.23±0.01vs1.37±0.03,p0.001)明顯低于與BMMNC組。1.3BMMNC組LVEF變化值明顯高于對(duì)照組LVEF變化值(meanchange3.5(Cl95,1.4to5.5),p=0.001)。BMMNC組ESV降低值明顯高于對(duì)照組ESV降低值(meanchange-7.6(Cl95,-11.9to-3.3),

12、p0.001)。BMMNC組WMSI變化值明顯高于對(duì)照組WMSI變化值(meanchange-0.16(Cl95,-0.24to-0.08),p0.001)。1.4SPECT結(jié)果提示,BMMNC組和對(duì)照組的心肌梗死面積(IS)均降低,組間心肌梗死面積比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.263±0.007inBMMNCgroupvs0.281±0.008incontrolgroup,p=0.10)。BMMNC組IS變化值與對(duì)照組IS變化值比較,無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(-9.5±0.9inBMMNCgroupvs-7.1±0.9incontrolgroup,p=0.06)。1

13、.5糖尿病合并STEMI患者行BMMNC移植后,4年隨訪時(shí)LVEF明顯提高(47.9±0.6vs40.3±0.7,p0.001)。對(duì)照組的糖尿病合并STEMI患者,4年隨訪時(shí)LVEF無明顯改善(43.1±0.8vs40.1±1.0,p=0.062)。1.6無論是在細(xì)胞移植組或是對(duì)照組,非糖尿病患者LVEF變化值均高于糖尿病患者LVEF變化值(BMMNC:(9.7±1.0)vs(7.6±0.9),p=0.258;Control(6.7±0.8)vs(3.0±0.7),p=0.014)。2.丹參酮IIA對(duì)糖尿病大鼠心臟

14、缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制2.1丹參酮IIA改善糖尿病大鼠缺血再灌注后左室功能:血活動(dòng)|教育教學(xué)論文|力學(xué)結(jié)果提示,與I/R組s0.154±0.024,p0.05)。Caspase-3活性測定結(jié)果提示TSN組caspa上一頁 1 2 3 4 5 6 7 下一頁 比較,TSN明顯增加左室等容期壓力最大變化速率( LVdp/dtmax:4378.4±365.0vs3989.9±415.8mmHg/s,p0.05;-LVdp/dtmax:4205.4±329.6vs3722.0&

15、#177;541.9mmHg/s,p0.05;)。在TSN注射前給予Wortmannin,-LVdp/dtmax明顯低于TSN組(3830.9±382.0vs4205.4±329.6mmHg/s,p0.05)。超聲心動(dòng)圖結(jié)果提示,與I/R組比較,TSN明顯降低LVESV(0.31±0.08vs0.40±0.07ml,p0.05)及LVEDV(1.36±0.05vs1.42±0.07ml,p0.05),同時(shí)明顯增加LVEF(0.770±0.058vs0.716±0.054,p0.05)。在TSN注射前給予Wortma

16、nnin,LVEF明顯低于TSN組(0.713±0.045vs0.770±0.058,p0.05),LVESV明顯高于TSN組(0.39±0.06vs0.31±0.08ml,p0.05)。2.2丹參酮IIA降低糖尿病大鼠缺血再灌注后心肌梗死面積:EvansBlue和TTC雙染法計(jì)算I/R后心肌梗死面積結(jié)果示,與I/R組比較,TSN組心肌梗死面積明顯降低(0.252±0.038vs0.327±0.027,p0.05),Wortmannin組心肌梗死面積明顯高于丹參酮IIA組(0.312±0.040vs0.252±0.

17、038,p0.05)。2.3丹參酮IIA降低糖尿病大鼠缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù):TUNEL染色結(jié)果表明,TSN組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于I/R組(0.114±0.026vs0.191±0.023,p0.05)和wortmannin組(0.114±0.026vs0.154±0.024,p0.05)。Caspase-3活性測定結(jié)果提示TSN組caspa(p0.05),TSN明顯降低p-NF-Bp65表達(dá)(p0.05),Wortmannin可抵消TSN對(duì)于p-NF-Bp65的影響(p0.05)。2.6丹參酮IIA降低糖尿病大鼠缺血再灌注后IL-6,TNF-

18、天生|教育論文網(wǎng)|:ELISA結(jié)果提示,與Sham組比較,I/R導(dǎo)致IL-6(p0.05)和TNF-(p0.05)表達(dá)明顯增高。與I/R組比較,TSN明顯降低IL-6(p0.05)和TNF-(p0.05)表達(dá)。與TSN組比較,Wo se-3活性明顯低于I/R組(60.0±17.2vs114.7±13.0,p0.05)和wortmannin組(60.0±17.2vs108.9±13.4,p0.05)。2.4丹參酮IIA明顯增加糖尿病大鼠缺血再灌注后p-Akt表達(dá):Westernblot法檢測p-Akt(Ser473)表達(dá),結(jié)果示,TSN明顯增加糖尿病大鼠缺

19、血再灌注后p-Akt(Ser473)表達(dá)(p0.05),Wortmannin則明顯抑制TSN引起的p-Akt表達(dá)增加(p0.05)。2.5丹參酮IIA降低糖尿病大鼠缺血再灌注后NF-Bp65磷酸化:Westernblot結(jié)果提示,與Sham組比較,I/R組NF-Bp65磷酸化明顯增加(p0.05),TSN明顯降低p-NF-Bp65表達(dá)(p0.05),Wortmannin可抵消TSN對(duì)于p-NF-Bp65的影響(p0.05)。2.6丹參酮IIA降低糖尿病大鼠缺血再灌注后IL-6,TNF-天生|教育論文網(wǎng)|:ELISA結(jié)果提示,與Sham組比較,I/R導(dǎo)致IL-6(p0.05)和TNF-(p0.0

20、5)表達(dá)明顯增高。與I/R組比較,TSN明顯降低IL-6(p0.05)和TNF-(p0.05)表達(dá)。與TSN組比較,Wortmannin預(yù)處理明顯增加IL-6(p0.05)和TNF-(p0.05)表達(dá)。2.7丹參酮IIA降低糖尿病大鼠缺血再灌注心肌中性粒細(xì)胞浸潤:與I/R組比較,TSN明顯降低心肌MPO活性(23.7±3.4vs30.3±4.7U/100mg,p0.05)。預(yù)先給予Wortmannin可抵消TSN的作用(29.0±4.2inwortmanningroupvs23.7±3.4U/100mginTSNgroup,p0.05)。研究結(jié)論1.BMMNC移植可安全有效改善STEMI患者左室功能,非糖尿病伴STEMI患者BMMNC移植療效可能優(yōu)急性心肌梗死缺血再灌注丹參酮IIA凋亡【論文提綱】：縮略語表5-8中文摘要8-14英文摘要14-22前言22-24文獻(xiàn)回顧24-43正文43-90實(shí)驗(yàn)