細胞培養(yǎng)匯總

1、細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)一、無菌實驗室二、常用的儀器設備三、細胞培養(yǎng)需要的物品四、細胞培養(yǎng)用液和培養(yǎng)基五、細胞培養(yǎng)基本技術一、無菌實驗室一、無菌實驗室 組成：組成： 更衣間：更衣間：放在外，供更換衣帽、鞋子等之用。放在外，供更換衣帽、鞋子等之用。 緩沖間：緩沖間：位于更衣間與操作間之間，也可同時與位于更衣間與操作間之間，也可同時與 幾個操作間相通。幾個操作間相通。 操作間：操作間：放在內(nèi)間，供無菌操作和細胞培養(yǎng)，房放在內(nèi)間，供無菌操作和細胞培養(yǎng)，房 間不受日光直射，大小適宜，高間不受日光直射，大小適宜，高2.5m2.5m。二、實驗室常用設備使用二、實驗室常用設備使用壓力蒸汽消毒器壓力蒸汽消毒器1.使用

2、前的準備：檢查進氣閥及排氣閥是否關閉，并使用前的準備：檢查進氣閥及排氣閥是否關閉，并加入適量水加入適量水。 2.裝放滅菌物：然后加蓋旋緊螺旋，密封。裝放滅菌物：然后加蓋旋緊螺旋，密封。 3.預熱及排氣：預熱及排氣：4.升壓保溫：一般為升壓保溫：一般為103.43kPa，溫度則相當于，溫度則相當于121.3時，持續(xù)時，持續(xù)1520min即可達到滅菌目的。即可達到滅菌目的。5.降壓開蓋取物：關電源，待其壓力下降至零時，方可開蓋取物。降壓開蓋取物：關電源，待其壓力下降至零時，方可開蓋取物。 【使用方法使用方法】干燥箱干燥箱 用于細胞培養(yǎng)的有些器械、器皿要烘干才能用于細胞培養(yǎng)的有些器械、器皿要烘干才能

3、使用，玻璃器皿需干熱消毒，因此，細胞培使用，玻璃器皿需干熱消毒，因此，細胞培養(yǎng)實驗室均配置有電熱干燥箱。干熱消毒時，養(yǎng)實驗室均配置有電熱干燥箱。干熱消毒時，升溫較高，一般需達到升溫較高，一般需達到160。 水純化裝置水純化裝置進行細胞培養(yǎng)時，配制各種培養(yǎng)液及試劑進行細胞培養(yǎng)時，配制各種培養(yǎng)液及試劑等均需使用三次蒸餾水；即使用于玻璃器等均需使用三次蒸餾水；即使用于玻璃器皿的沖洗，至少也應是二次蒸餾水。皿的沖洗，至少也應是二次蒸餾水。 蒸餾水器、壓力蒸氣消毒器和電熱干燥箱都蒸餾水器、壓力蒸氣消毒器和電熱干燥箱都是屬于大功率電器，使用時一定要注意是屬于大功率電器，使用時一定要注意用電用電安全安全，盡

4、量做到分開時間使用。，盡量做到分開時間使用。超凈工作臺CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱 培養(yǎng)箱：控溫及培養(yǎng)箱：控溫及的提供所需的的提供所需的CO2，使培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液的的pH保持穩(wěn)定。保持穩(wěn)定。 通常使用條件為通常使用條件為37 ，5 CO2CO2供氣凋節(jié)方法倒置顯微鏡倒置顯微鏡離心機離心機進行細胞培養(yǎng)時，常需要制備細胞懸液、調(diào)整細胞密度、洗滌、收集細胞等，因此要使用離心機。平衡是關鍵電子分析天平電子分析天平冰箱細胞冷凍儲存器細胞冷凍儲存器1、凍細胞和組織、凍細胞和組織2、注意液氮含量、注意液氮含量酸度計酸度計 酶標儀特殊設備 如有條件，可添置一些特殊或先進的設備儀器，使實驗室工作做得更有效、更精確、更深入

5、。有關的特殊或先進設備如下： 超低溫冰箱，70以下的冰箱便于儲存有些試劑及標本； 熒光顯微鏡，進行熒光染色樣本的觀察； 更精確及快速檢測細胞用的流式細胞儀等。三、細胞培養(yǎng)需要的物品：三、細胞培養(yǎng)需要的物品： 1、培養(yǎng)瓶（培養(yǎng)液、消化液以及PBS）。 2、藍口瓶、離心管、吸管、凍存管、燒杯、量筒、飯盒、培養(yǎng)皿、封口膜 3、槍頭（TIP頭） 4、培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿，細胞計數(shù)板 5、手術器械。 1 1、清洗、清洗 2 2、浸酸：、浸酸： 玻璃器皿浸泡到清潔液中玻璃器皿浸泡到清潔液中 浸泡時間：一般為過夜，不應少于浸泡時間：一般為過夜，不應少于6 6 小時小時 清潔液清潔液 常用三種：重鉻酸鉀（常用三種：

6、重鉻酸鉀（g g）濃硫酸（）濃硫酸（mlml）蒸餾水）蒸餾水（mlml） 強清潔液強清潔液 631000200 631000200 次強清洗液次強清洗液 120 2001000 120 2001000 弱清潔液弱清潔液 100 1001000100 1001000 需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈3 3、消毒、消毒四、細胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基四、細胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基 培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液水（三蒸水）水（三蒸水） 平衡鹽溶液（平衡鹽溶液（PBS） 消化液消化液 培養(yǎng)基培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 濾器、磁力攪拌器、燒杯、 量筒、注射器。

7、 貯液瓶（生理鹽水瓶）、 NaHCO3、胎牛（小牛）血清、青霉素、鏈霉素、三蒸水、培養(yǎng)基粉劑平衡鹽液體平衡鹽液體（Balanced salt solution, BSS）PBS、 Hanks分散組織、細胞分散組織、細胞作用：作用：（1）在進行原代培養(yǎng)過程中需分散組織、細胞。）在進行原代培養(yǎng)過程中需分散組織、細胞。（2）在傳代中要使細胞脫離附著的底物時均需使用消化液。）在傳代中要使細胞脫離附著的底物時均需使用消化液。類型：類型：組織細胞培養(yǎng)中常用的消化液為組織細胞培養(yǎng)中常用的消化液為胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二鈉胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二鈉（EDTA）及膠原酶溶液，）及膠原酶溶液，可以分別單獨使用或混

8、合使用。可以分別單獨使用或混合使用。特點：特點：1、胰蛋白酶的活力用解離酪蛋白的能力來表示，常用的有、胰蛋白酶的活力用解離酪蛋白的能力來表示，常用的有1：125和和1：250兩種。兩種。2、許多學者認為鈣、鎂離子和血清的存在都會降低胰蛋白酶的、許多學者認為鈣、鎂離子和血清的存在都會降低胰蛋白酶的活力?；盍ΑＯ毎麜r，加入一些血清（消化細胞時，加入一些血清（10%）或含血清的培養(yǎng)液，）或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用能終止消化作用。胰蛋白酶液胰蛋白酶液(Trypsin) 抗生素溶液w通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。w青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入

9、這兩種抗生素可預防絕大多數(shù)細菌污染。 培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。一般市售市售鏈霉素為100萬U/瓶培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基維持體外細胞生存和生長的溶液維持體外細胞生存和生長的溶液1、天然培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基 2、合成培養(yǎng)基：、合成培養(yǎng)基： 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 ：RPMI1640，DMEM等。等。 一般需加血清等一般需加血清等 需要補加NaHCO3，調(diào)PH。 根據(jù)包裝袋上的要求和實驗需要補加NaHCO3和谷氨酰胺。 加抗生素： 上述溶液配制好后，用過濾法消毒除菌，采用0.22m。分裝于玻璃瓶中，使用時再加血清。四、滅活胎牛血清（FBS）與分裝過程： 1、一般外購的血清

10、只作過滅菌，在用前常需進行滅活處理。（加溫到56，30min），以消除補體活性，未滅活血清應保存在20冰箱。 牛血清分裝：牛血清分裝： 在無菌的條件下一般分裝成10ml一管，貯存于-20OC. 使用時放置4OC冰箱過夜色解凍。五、細胞培養(yǎng)基本技術五、細胞培養(yǎng)基本技術1、細胞原代培養(yǎng)、細胞原代培養(yǎng)2、細胞生長狀況的觀察、細胞生長狀況的觀察3、細胞傳代、細胞傳代4、細胞凍存、復蘇和運輸、細胞凍存、復蘇和運輸5、細胞活力檢測、細胞活力檢測6、細胞周期檢測、細胞周期檢測7、細胞凋亡檢測、細胞凋亡檢測8、細胞凋亡的流式分析、細胞凋亡的流式分析1、細胞原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，是從供體取得組

11、織細胞后在體外進行的首次培養(yǎng)。 1、取材、取材 2、漂洗、漂洗 3、剪切、剪切 4、消化、消化 5、過濾、過濾 6、清洗、清洗 7、計數(shù)、計數(shù) 8、接種、接種2、細胞生長狀況的觀察培養(yǎng)細胞生長狀況常規(guī)檢查 1、培養(yǎng)液：顏色與透明度的變化 2、細胞生長狀況。 3、細胞形態(tài)變化。 4、微生物污染。1、培養(yǎng)液PH值（顏色變化） 變黃，表示PH值下降，細胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生的酸性物不斷積累導致。 變紅或紫紅色，表示PH值上升，細胞生長停滯、死亡。 一般生長穩(wěn)定的細胞需要2-3天換液1次，生長慢的細胞需要3-4天換液一次。原代細胞換液通常每周兩次，每次換半量或1/5-1/3量。原代細胞第1次換液時，切記

12、不要把培養(yǎng)液全部倒掉。(2)細胞系(株)換液: 條件合適時生長迅速，過夜就變黃，可進行全量換液。這種情況下，最好減少細胞接種數(shù)，延長換液的時間。 方法:2、細胞形態(tài)變化： 生長良好細胞：透明度大，折光性強，輪廓不清。 生長狀態(tài)不良時，細胞折光性變?nèi)?，輪廓增強，胞質中常出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質，細胞之間空隙加大。3、微生物污染： 培養(yǎng)液顏色與透明度： 培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細胞菌。 支原體污染，沒有明顯癥狀，但細胞生長卻明顯變緩。細胞培養(yǎng)的污染和檢測細胞培養(yǎng)的污染和檢測 細胞污染的種類細胞污染的種類 細菌、酵母菌、霉菌和病毒細菌、酵母菌、霉菌和病毒 污染源污染源 無菌操作技術不當無菌操作技

13、術不當 操作室環(huán)境不佳操作室環(huán)境不佳 污染之血清污染之血清 污染之細胞污染之細胞 細菌培養(yǎng)液被洋蔥佰克霍爾德菌污染了。細菌培養(yǎng)液被洋蔥佰克霍爾德菌污染了。洋蔥佰克霍爾德菌（洋蔥佰克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）原屬假單胞菌）原屬假單胞菌屬，是植物病原菌。屬，是植物病原菌。 白色念珠菌污染白色念珠菌污染 真菌感染真菌感染支原體污染電鏡照片支原體污染電鏡照片, 煎蛋狀和其他形狀煎蛋狀和其他形狀 3、細胞傳代（貼壁細胞）： 1. 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液 2.加入0.5-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準），然后兩種方式處理：一種30S后，吸去消化液，剩余的酶

14、液繼續(xù)作用，后在相差顯微鏡下觀察。第二種，不吸去消化液，靜置2-10 min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。 3. 吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培養(yǎng)液。 4. 用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液(按順序)。然后離心沉淀細胞。 5. 吸取1:2-5細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。 6. 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。 7. 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 4、細胞凍存、復蘇和運輸、細胞凍存、復蘇和運輸凍存和復蘇的原則：慢凍快融 當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)

15、生大的冰晶；相反結晶就大，大結晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。低溫保護劑的應用 常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。細胞凍存方法 1、預先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基10% DMSO 2、取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液, 用吸管吹打制成細胞懸液（1106 5 106細胞/ml) 3、加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。細胞復

16、蘇方法 （l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分鐘左右）。 （2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的5-10倍以上。 （3）低速離心10分鐘。 （4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。細胞運輸： （1）長距離運輸（幾天）長距離運輸（幾天） 選擇生長良好細胞，換細胞液，補充新培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋， 瓶子口用膠密封，并用棉花包，放在攜帶者貼身口袋帶回，或用包裝盒空運。 （2）短距離運輸（幾小時）短距離運輸（幾小時） 去掉大部分生長液，僅留少量液體覆蓋單層細胞，防止細胞干燥，將細胞附著面朝上帶回。 （3）液氮凍存運輸）液氮凍存運輸5 5、細胞活力檢測、細胞

17、活力檢測 在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力。 應用：由組織中分離細胞 復蘇后的細胞 藥物篩選 方法：細胞計數(shù)+臺盼蘭染色 MTT法（1 1）細胞計數(shù)）細胞計數(shù) 將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。 將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。 靜置3分鐘。 鏡下觀察計數(shù)細胞濃度的計算： Volume (體積體積) =長 x 寬 x 深度 = 1 mm x 1 mm x 0.1 mm = 0.1 mm3 = 1 x 10-4 cm3 (ml) 細胞密度細胞密度(個個/mL) = 4個大方格的個大方格的細胞總數(shù)細

18、胞總數(shù)/4 10-4 =4個大方格的細胞總數(shù)個大方格的細胞總數(shù)/4 104（2）臺盼蘭排斥染色原理：死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見蘭色的細胞，活細胞不被染色，呈透明狀。步驟： 制備單細胞懸液，并適當稀釋（105/ml） 9滴細胞懸液+1滴0.4%臺盼蘭染液，混勻染色。 吸取少許懸液涂于計數(shù)板上。 3分鐘內(nèi)計數(shù)活細胞和死細胞細胞數(shù)細胞數(shù)/ml/ml（4 4大格細胞數(shù)之和大格細胞數(shù)之和/ 4 / 4 ）10104 4稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)細胞活力（）未著色細胞數(shù)細胞活力（）未著色細胞數(shù)總細胞數(shù)總細胞數(shù)100100 (3) (3) 四唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法 四唑鹽（MTT）：噻唑藍

19、原理：原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與活細胞數(shù)成正比。 優(yōu)點：優(yōu)點：簡單快速、靈敏、經(jīng)濟 應用應用: :新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。操作流程：操作流程：細胞接種細胞接種9696孔板（孔板（ 200ul200ul，10103 3-10-104 4 / /孔）孔）貼壁后加處理因素貼壁后加處理因素加入加入MTT 20 ul MTT 20 ul （5mg/ml5mg/ml）, ,培養(yǎng)培養(yǎng)4 h4 h酶標儀檢測酶標儀檢測0D0D值（波長值（波長490nm49

20、0nm）吸出培養(yǎng)液，加入吸出培養(yǎng)液，加入DMSO150ul,DMSO150ul,搖床震蕩搖床震蕩10 min10 min注意事項選擇選擇適當?shù)募毎臃N濃度適當?shù)募毎臃N濃度，保證細胞培養(yǎng)結束時濃度不至，保證細胞培養(yǎng)結束時濃度不至于過滿于過滿種板技術：種板技術：均勻均勻實驗時應設置調(diào)零孔，溶媒孔，加藥孔。實驗時應設置調(diào)零孔，溶媒孔，加藥孔。調(diào)零孔：培養(yǎng)基、調(diào)零孔：培養(yǎng)基、MTTMTT、DMSODMSO。（無細胞）。（無細胞）溶媒孔：培養(yǎng)液、溶媒孔：培養(yǎng)液、MTTMTT、DMSODMSO、細胞、溶酶、細胞、溶酶加藥孔：培養(yǎng)液、加藥孔：培養(yǎng)液、MTTMTT、DMSODMSO、細胞、不同濃度的藥物、細

21、胞、不同濃度的藥物 （一般（一般5-75-7個梯度，設個梯度，設3-53-5個復孔）個復孔）避免血清干擾：一般選小于避免血清干擾：一般選小于10%10%胎牛血清的培養(yǎng)液進行。胎牛血清的培養(yǎng)液進行。邊緣效應邊緣效應：周邊孔加入：周邊孔加入PBSPBS6 6、細胞周期檢測、細胞周期檢測流式細胞術PI染色細胞周期細胞周期: :細胞每一次分裂增殖的周期細胞每一次分裂增殖的周期流式細胞術PI染色檢測細胞周期 原理：原理：碘化丙錠（碘化丙錠（PIPI）可與細胞內(nèi)可與細胞內(nèi)DNA DNA 和和RNA RNA 結合結合, ,采用采用RNA RNA 酶將酶將RNA RNA 消化后消化后, ,通過流式細胞術檢測到

22、的與通過流式細胞術檢測到的與DNA DNA 結結合的合的PI PI 的熒光強度直接的熒光強度直接反映了細胞內(nèi)反映了細胞內(nèi)DNADNA含量的多少含量的多少。 通過流式細胞術通過流式細胞術PIPI染色法對細胞內(nèi)染色法對細胞內(nèi)DNA DNA 含量進行檢測時含量進行檢測時, ,可以區(qū)分細胞周期各時相：可以區(qū)分細胞周期各時相： G1/ G0 期具有二倍體細胞的DNA 含量 G2/ M 期具有四倍體細胞的DNA 含量(4N) S 期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間 應用：通過流式細胞儀分析應用：通過流式細胞儀分析各時期的細胞百分數(shù)各時期的細胞百分數(shù)，可檢測，可檢測細胞的增殖周期。細胞的增殖周期。 增加膜

23、通透性增加膜通透性消化消化RNARNA7 7、細胞凋亡的檢測、細胞凋亡的檢測 凋亡形態(tài)學特征凋亡形態(tài)學特征細胞體積變小，胞質濃縮。細胞體積變小，胞質濃縮。胞膜結構完整，有泡狀突起。胞膜結構完整，有泡狀突起。核染色質濃縮，聚集核膜周圍。核染色質濃縮，聚集核膜周圍。細胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體細胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體 (Apoptotic bodies)(Apoptotic bodies)。無內(nèi)容物外溢，因而不引起周圍的炎癥反應。無內(nèi)容物外溢，因而不引起周圍的炎癥反應。 形態(tài)學鑒定形態(tài)學鑒定細胞膜結構改變分析細胞膜結構改變分析 胞膜通透性增加：胞膜通透性增加：改變細胞對一些核染料物質改變細胞對一些核染料物

24、質（ DAPIDAPI、Hoechst Hoechst 、 PI PI ）的通透性，利用著色）的通透性，利用著色結果的差異區(qū)別檢測壞死和凋亡細胞結果的差異區(qū)別檢測壞死和凋亡細胞 膜內(nèi)側磷脂酰絲氨酸（膜內(nèi)側磷脂酰絲氨酸（PSPS）外翻到膜表面：）外翻到膜表面： Annexin VAnnexin V法法常用方法有：常用方法有：DAPIDAPI、HoechstHoechst、 PI PI單染、單染、Heochst/PIHeochst/PI雙染、雙染、Annexin-V/PIAnnexin-V/PI雙染等。雙染等。DAPI DAPIDAPI是一種是一種可以穿透細胞膜可以穿透細胞膜的藍色熒光染料。的藍色

25、熒光染料。 與與DNADNA的結合是非嵌入式的，主要結合在的結合是非嵌入式的，主要結合在DNADNA的的A-TA-T堿基區(qū)堿基區(qū) Hoechst 染色染色 HoechstHoechst為為膜通透性膜通透性核酸染料，核酸染料， DNADNA結合型熒光染料結合型熒光染料, ,可以嵌合到堿基分子可以嵌合到堿基分子 能進入正常細胞，凋亡細胞的胞核會呈致密濃染，或能進入正常細胞，凋亡細胞的胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染呈碎塊狀致密濃染 凋亡細胞凋亡細胞PI（Propidium Iodide, 碘化丙啶碘化丙啶 ） 是一種常用的細胞核熒光染色劑。是一種常用的細胞核熒光染色劑。 它它不能透過完整的細胞

26、膜不能透過完整的細胞膜，但在，但在凋亡中晚凋亡中晚期的細胞和死細胞期的細胞和死細胞，PIPI能夠透過細胞膜而能夠透過細胞膜而將細胞核染紅將細胞核染紅 將將Annexin-VAnnexin-V、HeochstHeochst與與PIPI匹配匹配使用，就使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來開來Heochst/PIHeochst/PI雙染雙染凋亡細胞膜通透性增高，凋亡細胞膜通透性增高，HoechstHoechst熒光（藍色）強度增高熒光（藍色）強度增高PIPI不能進入細胞膜完整的活細胞中不能進入細胞膜完整的活細胞中：正常細胞和凋亡細胞拒染，壞死細胞由：正

27、常細胞和凋亡細胞拒染，壞死細胞由于失去膜完整性可染（紅色）。于失去膜完整性可染（紅色）。磷脂酰絲氨酸外翻分析（磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法） 磷脂酰絲氨酸（磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PSPhosphatidylserine, PS）在細胞凋亡的在細胞凋亡的早期可從細胞膜的內(nèi)側翻轉到細胞膜的表面早期可從細胞膜的內(nèi)側翻轉到細胞膜的表面 Annexin-VAnnexin-V是一種是一種Ca2 Ca2 依賴性磷脂結合蛋白，能與依賴性磷脂結合蛋白，能與PSPS高親高親和力特異性結合。和力特異性結合。 將將Annexin-VAnnexin-V

28、進行熒光素（進行熒光素（FITCFITC）或）或biotinbiotin標記，利用流標記，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。Annexin V/PIAnnexin V/PI雙染色法雙染色法 8 8、細胞凋亡的流式分析、細胞凋亡的流式分析利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單細胞進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術。 流式細胞術（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）:流式細胞儀工作原理經(jīng)熒光染色的細胞從噴嘴中高速噴出，通過一個聚焦的光源進而通過各種光敏元件測量這些細胞發(fā)射的散射光和熒光，經(jīng)計算機處理得

29、到多種信息參數(shù)信號檢測-散射光 前散射光（前散射光（FSC)FSC)與細胞的大小有關與細胞的大小有關側散射光側散射光(SSC)(SSC)反映細胞內(nèi)的顆粒反映細胞內(nèi)的顆粒多少多少信號檢測-熒光信號 X X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數(shù)通道數(shù)”表示，表示，與光強度之間線性關系或對數(shù)關系與光強度之間線性關系或對數(shù)關系Y Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號特征性細胞的頻率軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號特征性細胞的頻率 流式細胞儀檢測細胞凋亡常用的三種方法 （一）（一）PIPI單染色法單染色法（二）（二）Heochst 33342/PIHeochst 33342/PI雙染色法雙染色法（三）（三）Annexin V/PIAnnexin V/PI雙染色法雙染色法PI單染色法Heochst 33342/PI雙染色法 凋亡細胞膜通透性增高，Hoechst 33342熒光（藍色）強度增高 PI不能進入細胞膜完整的活細胞中：正常細胞和凋亡細胞拒染，壞死細胞由于膜完整性可染（紅