細(xì)胞培養(yǎng)匯總

1、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)一、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室二、常用的儀器設(shè)備三、細(xì)胞培養(yǎng)需要的物品四、細(xì)胞培養(yǎng)用液和培養(yǎng)基五、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)一、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室一、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室 組成：組成： 更衣間：更衣間：放在外，供更換衣帽、鞋子等之用。放在外，供更換衣帽、鞋子等之用。 緩沖間：緩沖間：位于更衣間與操作間之間，也可同時(shí)與位于更衣間與操作間之間，也可同時(shí)與 幾個(gè)操作間相通。幾個(gè)操作間相通。 操作間：操作間：放在內(nèi)間，供無(wú)菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)，房放在內(nèi)間，供無(wú)菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)，房 間不受日光直射，大小適宜，高間不受日光直射，大小適宜，高2.5m2.5m。二、實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備使用二、實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備使用壓力蒸汽消毒器壓力蒸汽消毒器1.使用

2、前的準(zhǔn)備：檢查進(jìn)氣閥及排氣閥是否關(guān)閉，并使用前的準(zhǔn)備：檢查進(jìn)氣閥及排氣閥是否關(guān)閉，并加入適量水加入適量水。 2.裝放滅菌物：然后加蓋旋緊螺旋，密封。裝放滅菌物：然后加蓋旋緊螺旋，密封。 3.預(yù)熱及排氣：預(yù)熱及排氣：4.升壓保溫：一般為升壓保溫：一般為103.43kPa，溫度則相當(dāng)于，溫度則相當(dāng)于121.3時(shí)，持續(xù)時(shí)，持續(xù)1520min即可達(dá)到滅菌目的。即可達(dá)到滅菌目的。5.降壓開蓋取物：關(guān)電源，待其壓力下降至零時(shí)，方可開蓋取物。降壓開蓋取物：關(guān)電源，待其壓力下降至零時(shí)，方可開蓋取物。 【使用方法使用方法】干燥箱干燥箱 用于細(xì)胞培養(yǎng)的有些器械、器皿要烘干才能用于細(xì)胞培養(yǎng)的有些器械、器皿要烘干才能

3、使用，玻璃器皿需干熱消毒，因此，細(xì)胞培使用，玻璃器皿需干熱消毒，因此，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室均配置有電熱干燥箱。干熱消毒時(shí)，養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室均配置有電熱干燥箱。干熱消毒時(shí)，升溫較高，一般需達(dá)到升溫較高，一般需達(dá)到160。 水純化裝置水純化裝置進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，配制各種培養(yǎng)液及試劑進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，配制各種培養(yǎng)液及試劑等均需使用三次蒸餾水；即使用于玻璃器等均需使用三次蒸餾水；即使用于玻璃器皿的沖洗，至少也應(yīng)是二次蒸餾水。皿的沖洗，至少也應(yīng)是二次蒸餾水。 蒸餾水器、壓力蒸氣消毒器和電熱干燥箱都蒸餾水器、壓力蒸氣消毒器和電熱干燥箱都是屬于大功率電器，使用時(shí)一定要注意是屬于大功率電器，使用時(shí)一定要注意用電用電安全安全，盡

4、量做到分開時(shí)間使用。，盡量做到分開時(shí)間使用。超凈工作臺(tái)CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱 培養(yǎng)箱：控溫及培養(yǎng)箱：控溫及的提供所需的的提供所需的CO2，使培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液的的pH保持穩(wěn)定。保持穩(wěn)定。 通常使用條件為通常使用條件為37 ，5 CO2CO2供氣凋節(jié)方法倒置顯微鏡倒置顯微鏡離心機(jī)離心機(jī)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，常需要制備細(xì)胞懸液、調(diào)整細(xì)胞密度、洗滌、收集細(xì)胞等，因此要使用離心機(jī)。平衡是關(guān)鍵電子分析天平電子分析天平冰箱細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器1、凍細(xì)胞和組織、凍細(xì)胞和組織2、注意液氮含量、注意液氮含量酸度計(jì)酸度計(jì) 酶標(biāo)儀特殊設(shè)備 如有條件，可添置一些特殊或先進(jìn)的設(shè)備儀器，使實(shí)驗(yàn)室工作做得更有效、更精確、更深入

5、。有關(guān)的特殊或先進(jìn)設(shè)備如下： 超低溫冰箱，70以下的冰箱便于儲(chǔ)存有些試劑及標(biāo)本； 熒光顯微鏡，進(jìn)行熒光染色樣本的觀察； 更精確及快速檢測(cè)細(xì)胞用的流式細(xì)胞儀等。三、細(xì)胞培養(yǎng)需要的物品：三、細(xì)胞培養(yǎng)需要的物品： 1、培養(yǎng)瓶（培養(yǎng)液、消化液以及PBS）。 2、藍(lán)口瓶、離心管、吸管、凍存管、燒杯、量筒、飯盒、培養(yǎng)皿、封口膜 3、槍頭（TIP頭） 4、培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿，細(xì)胞計(jì)數(shù)板 5、手術(shù)器械。 1 1、清洗、清洗 2 2、浸酸：、浸酸： 玻璃器皿浸泡到清潔液中玻璃器皿浸泡到清潔液中 浸泡時(shí)間：一般為過(guò)夜，不應(yīng)少于浸泡時(shí)間：一般為過(guò)夜，不應(yīng)少于6 6 小時(shí)小時(shí) 清潔液清潔液 常用三種：重鉻酸鉀（常用三種：

6、重鉻酸鉀（g g）濃硫酸（）濃硫酸（mlml）蒸餾水）蒸餾水（mlml） 強(qiáng)清潔液強(qiáng)清潔液 631000200 631000200 次強(qiáng)清洗液次強(qiáng)清洗液 120 2001000 120 2001000 弱清潔液弱清潔液 100 1001000100 1001000 需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈3 3、消毒、消毒四、細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基四、細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基 培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液水（三蒸水）水（三蒸水） 平衡鹽溶液（平衡鹽溶液（PBS） 消化液消化液 培養(yǎng)基培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 濾器、磁力攪拌器、燒杯、 量筒、注射器。

7、 貯液瓶（生理鹽水瓶）、 NaHCO3、胎牛（小牛）血清、青霉素、鏈霉素、三蒸水、培養(yǎng)基粉劑平衡鹽液體平衡鹽液體（Balanced salt solution, BSS）PBS、 Hanks分散組織、細(xì)胞分散組織、細(xì)胞作用：作用：（1）在進(jìn)行原代培養(yǎng)過(guò)程中需分散組織、細(xì)胞。）在進(jìn)行原代培養(yǎng)過(guò)程中需分散組織、細(xì)胞。（2）在傳代中要使細(xì)胞脫離附著的底物時(shí)均需使用消化液。）在傳代中要使細(xì)胞脫離附著的底物時(shí)均需使用消化液。類型：類型：組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的消化液為組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的消化液為胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二鈉胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二鈉（EDTA）及膠原酶溶液，）及膠原酶溶液，可以分別單獨(dú)使用或混

8、合使用?？梢苑謩e單獨(dú)使用或混合使用。特點(diǎn)：特點(diǎn)：1、胰蛋白酶的活力用解離酪蛋白的能力來(lái)表示，常用的有、胰蛋白酶的活力用解離酪蛋白的能力來(lái)表示，常用的有1：125和和1：250兩種。兩種。2、許多學(xué)者認(rèn)為鈣、鎂離子和血清的存在都會(huì)降低胰蛋白酶的、許多學(xué)者認(rèn)為鈣、鎂離子和血清的存在都會(huì)降低胰蛋白酶的活力?；盍ΑＯ?xì)胞時(shí)，加入一些血清（消化細(xì)胞時(shí)，加入一些血清（10%）或含血清的培養(yǎng)液，）或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用能終止消化作用。胰蛋白酶液胰蛋白酶液(Trypsin) 抗生素溶液w通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。w青霉素主要是對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入

9、這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。 培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。一般市售市售鏈霉素為100萬(wàn)U/瓶培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液1、天然培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基 2、合成培養(yǎng)基：、合成培養(yǎng)基： 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 ：RPMI1640，DMEM等。等。 一般需加血清等一般需加血清等 需要補(bǔ)加NaHCO3，調(diào)PH。 根據(jù)包裝袋上的要求和實(shí)驗(yàn)需要補(bǔ)加NaHCO3和谷氨酰胺。 加抗生素： 上述溶液配制好后，用過(guò)濾法消毒除菌，采用0.22m。分裝于玻璃瓶中，使用時(shí)再加血清。四、滅活胎牛血清（FBS）與分裝過(guò)程： 1、一般外購(gòu)的血清

10、只作過(guò)滅菌，在用前常需進(jìn)行滅活處理。（加溫到56，30min），以消除補(bǔ)體活性，未滅活血清應(yīng)保存在20冰箱。 牛血清分裝：牛血清分裝： 在無(wú)菌的條件下一般分裝成10ml一管，貯存于-20OC. 使用時(shí)放置4OC冰箱過(guò)夜色解凍。五、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)五、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)1、細(xì)胞原代培養(yǎng)、細(xì)胞原代培養(yǎng)2、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察3、細(xì)胞傳代、細(xì)胞傳代4、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸5、細(xì)胞活力檢測(cè)、細(xì)胞活力檢測(cè)6、細(xì)胞周期檢測(cè)、細(xì)胞周期檢測(cè)7、細(xì)胞凋亡檢測(cè)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)8、細(xì)胞凋亡的流式分析、細(xì)胞凋亡的流式分析1、細(xì)胞原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，是從供體取得組

11、織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。 1、取材、取材 2、漂洗、漂洗 3、剪切、剪切 4、消化、消化 5、過(guò)濾、過(guò)濾 6、清洗、清洗 7、計(jì)數(shù)、計(jì)數(shù) 8、接種、接種2、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況常規(guī)檢查 1、培養(yǎng)液：顏色與透明度的變化 2、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。 3、細(xì)胞形態(tài)變化。 4、微生物污染。1、培養(yǎng)液PH值（顏色變化） 變黃，表示PH值下降，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，代謝產(chǎn)生的酸性物不斷積累導(dǎo)致。 變紅或紫紅色，表示PH值上升，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、死亡。 一般生長(zhǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞需要2-3天換液1次，生長(zhǎng)慢的細(xì)胞需要3-4天換液一次。原代細(xì)胞換液通常每周兩次，每次換半量或1/5-1/3量。原代細(xì)胞第1次換液時(shí)，切記

12、不要把培養(yǎng)液全部倒掉。(2)細(xì)胞系(株)換液: 條件合適時(shí)生長(zhǎng)迅速，過(guò)夜就變黃，可進(jìn)行全量換液。這種情況下，最好減少細(xì)胞接種數(shù)，延長(zhǎng)換液的時(shí)間。 方法:2、細(xì)胞形態(tài)變化： 生長(zhǎng)良好細(xì)胞：透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。 生長(zhǎng)狀態(tài)不良時(shí)，細(xì)胞折光性變?nèi)酰喞鰪?qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙加大。3、微生物污染： 培養(yǎng)液顏色與透明度： 培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細(xì)胞菌。 支原體污染，沒有明顯癥狀，但細(xì)胞生長(zhǎng)卻明顯變緩。細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè) 細(xì)胞污染的種類細(xì)胞污染的種類 細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒 污染源污染源 無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)無(wú)菌操作技

13、術(shù)不當(dāng) 操作室環(huán)境不佳操作室環(huán)境不佳 污染之血清污染之血清 污染之細(xì)胞污染之細(xì)胞 細(xì)菌培養(yǎng)液被洋蔥佰克霍爾德菌污染了。細(xì)菌培養(yǎng)液被洋蔥佰克霍爾德菌污染了。洋蔥佰克霍爾德菌（洋蔥佰克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）原屬假單胞菌）原屬假單胞菌屬，是植物病原菌。屬，是植物病原菌。 白色念珠菌污染白色念珠菌污染 真菌感染真菌感染支原體污染電鏡照片支原體污染電鏡照片, 煎蛋狀和其他形狀煎蛋狀和其他形狀 3、細(xì)胞傳代（貼壁細(xì)胞）： 1. 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液 2.加入0.5-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)），然后兩種方式處理：一種30S后，吸去消化液，剩余的酶

14、液繼續(xù)作用，后在相差顯微鏡下觀察。第二種，不吸去消化液，靜置2-10 min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。 3. 吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培養(yǎng)液。 4. 用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液(按順序)。然后離心沉淀細(xì)胞。 5. 吸取1:2-5細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。 6. 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。 7. 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 4、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)

15、生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法 1、預(yù)先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基10% DMSO 2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉? 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1106 5 106細(xì)胞/ml) 3、加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。細(xì)胞復(fù)

16、蘇方法 （l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分鐘左右）。 （2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的5-10倍以上。 （3）低速離心10分鐘。 （4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。細(xì)胞運(yùn)輸： （1）長(zhǎng)距離運(yùn)輸（幾天）長(zhǎng)距離運(yùn)輸（幾天） 選擇生長(zhǎng)良好細(xì)胞，換細(xì)胞液，補(bǔ)充新培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋， 瓶子口用膠密封，并用棉花包，放在攜帶者貼身口袋帶回，或用包裝盒空運(yùn)。 （2）短距離運(yùn)輸（幾小時(shí)）短距離運(yùn)輸（幾小時(shí)） 去掉大部分生長(zhǎng)液，僅留少量液體覆蓋單層細(xì)胞，防止細(xì)胞干燥，將細(xì)胞附著面朝上帶回。 （3）液氮凍存運(yùn)輸）液氮凍存運(yùn)輸5 5、細(xì)胞活力檢測(cè)、細(xì)胞

17、活力檢測(cè) 在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力。 應(yīng)用：由組織中分離細(xì)胞 復(fù)蘇后的細(xì)胞 藥物篩選 方法：細(xì)胞計(jì)數(shù)+臺(tái)盼蘭染色 MTT法（1 1）細(xì)胞計(jì)數(shù)）細(xì)胞計(jì)數(shù) 將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。 靜置3分鐘。 鏡下觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度的計(jì)算： Volume (體積體積) =長(zhǎng) x 寬 x 深度 = 1 mm x 1 mm x 0.1 mm = 0.1 mm3 = 1 x 10-4 cm3 (ml) 細(xì)胞密度細(xì)胞密度(個(gè)個(gè)/mL) = 4個(gè)大方格的個(gè)大方格的細(xì)胞總數(shù)細(xì)

18、胞總數(shù)/4 10-4 =4個(gè)大方格的細(xì)胞總數(shù)個(gè)大方格的細(xì)胞總數(shù)/4 104（2）臺(tái)盼蘭排斥染色原理：死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，呈透明狀。步驟： 制備單細(xì)胞懸液，并適當(dāng)稀釋（105/ml） 9滴細(xì)胞懸液+1滴0.4%臺(tái)盼蘭染液，混勻染色。 吸取少許懸液涂于計(jì)數(shù)板上。 3分鐘內(nèi)計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/ml/ml（4 4大格細(xì)胞數(shù)之和大格細(xì)胞數(shù)之和/ 4 / 4 ）10104 4稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)細(xì)胞活力（）未著色細(xì)胞數(shù)細(xì)胞活力（）未著色細(xì)胞數(shù)總細(xì)胞數(shù)總細(xì)胞數(shù)100100 (3) (3) 四唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法 四唑鹽（MTT）：噻唑藍(lán)

19、原理：原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)成正比。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速、靈敏、經(jīng)濟(jì) 應(yīng)用應(yīng)用: :新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。操作流程：操作流程：細(xì)胞接種細(xì)胞接種9696孔板（孔板（ 200ul200ul，10103 3-10-104 4 / /孔）孔）貼壁后加處理因素貼壁后加處理因素加入加入MTT 20 ul MTT 20 ul （5mg/ml5mg/ml）, ,培養(yǎng)培養(yǎng)4 h4 h酶標(biāo)儀檢測(cè)酶標(biāo)儀檢測(cè)0D0D值（波長(zhǎng)值（波長(zhǎng)490nm49

20、0nm）吸出培養(yǎng)液，加入吸出培養(yǎng)液，加入DMSO150ul,DMSO150ul,搖床震蕩搖床震蕩10 min10 min注意事項(xiàng)選擇選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度，保證細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時(shí)濃度不至，保證細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時(shí)濃度不至于過(guò)滿于過(guò)滿種板技術(shù)：種板技術(shù)：均勻均勻?qū)嶒?yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，溶媒孔，加藥孔。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，溶媒孔，加藥孔。調(diào)零孔：培養(yǎng)基、調(diào)零孔：培養(yǎng)基、MTTMTT、DMSODMSO。（無(wú)細(xì)胞）。（無(wú)細(xì)胞）溶媒孔：培養(yǎng)液、溶媒孔：培養(yǎng)液、MTTMTT、DMSODMSO、細(xì)胞、溶酶、細(xì)胞、溶酶加藥孔：培養(yǎng)液、加藥孔：培養(yǎng)液、MTTMTT、DMSODMSO、細(xì)胞、不同濃度的藥物、細(xì)

21、胞、不同濃度的藥物 （一般（一般5-75-7個(gè)梯度，設(shè)個(gè)梯度，設(shè)3-53-5個(gè)復(fù)孔）個(gè)復(fù)孔）避免血清干擾：一般選小于避免血清干擾：一般選小于10%10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。邊緣效應(yīng)邊緣效應(yīng)：周邊孔加入：周邊孔加入PBSPBS6 6、細(xì)胞周期檢測(cè)、細(xì)胞周期檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)PI染色細(xì)胞周期細(xì)胞周期: :細(xì)胞每一次分裂增殖的周期細(xì)胞每一次分裂增殖的周期流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期 原理：原理：碘化丙錠（碘化丙錠（PIPI）可與細(xì)胞內(nèi)可與細(xì)胞內(nèi)DNA DNA 和和RNA RNA 結(jié)合結(jié)合, ,采用采用RNA RNA 酶將酶將RNA RNA 消化后消化后, ,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到

22、的與通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的與DNA DNA 結(jié)結(jié)合的合的PI PI 的熒光強(qiáng)度直接的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)反映了細(xì)胞內(nèi)DNADNA含量的多少含量的多少。 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)PIPI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA DNA 含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí), ,可以區(qū)分細(xì)胞周期各時(shí)相：可以區(qū)分細(xì)胞周期各時(shí)相： G1/ G0 期具有二倍體細(xì)胞的DNA 含量 G2/ M 期具有四倍體細(xì)胞的DNA 含量(4N) S 期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間 應(yīng)用：通過(guò)流式細(xì)胞儀分析應(yīng)用：通過(guò)流式細(xì)胞儀分析各時(shí)期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)各時(shí)期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，可檢測(cè)，可檢測(cè)細(xì)胞的增殖周期。細(xì)胞的增殖周期。 增加膜

23、通透性增加膜通透性消化消化RNARNA7 7、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)、細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 凋亡形態(tài)學(xué)特征凋亡形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮。細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮。胞膜結(jié)構(gòu)完整，有泡狀突起。胞膜結(jié)構(gòu)完整，有泡狀突起。核染色質(zhì)濃縮，聚集核膜周圍。核染色質(zhì)濃縮，聚集核膜周圍。細(xì)胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體細(xì)胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體 (Apoptotic bodies)(Apoptotic bodies)。無(wú)內(nèi)容物外溢，因而不引起周圍的炎癥反應(yīng)。無(wú)內(nèi)容物外溢，因而不引起周圍的炎癥反應(yīng)。 形態(tài)學(xué)鑒定形態(tài)學(xué)鑒定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變分析細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變分析 胞膜通透性增加：胞膜通透性增加：改變細(xì)胞對(duì)一些核染料物質(zhì)改變細(xì)胞對(duì)一些核染料物

24、質(zhì)（ DAPIDAPI、Hoechst Hoechst 、 PI PI ）的通透性，利用著色）的通透性，利用著色結(jié)果的差異區(qū)別檢測(cè)壞死和凋亡細(xì)胞結(jié)果的差異區(qū)別檢測(cè)壞死和凋亡細(xì)胞 膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸（膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸（PSPS）外翻到膜表面：）外翻到膜表面： Annexin VAnnexin V法法常用方法有：常用方法有：DAPIDAPI、HoechstHoechst、 PI PI單染、單染、Heochst/PIHeochst/PI雙染、雙染、Annexin-V/PIAnnexin-V/PI雙染等。雙染等。DAPI DAPIDAPI是一種是一種可以穿透細(xì)胞膜可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料。的藍(lán)色

25、熒光染料。 與與DNADNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNADNA的的A-TA-T堿基區(qū)堿基區(qū) Hoechst 染色染色 HoechstHoechst為為膜通透性膜通透性核酸染料，核酸染料， DNADNA結(jié)合型熒光染料結(jié)合型熒光染料, ,可以嵌合到堿基分子可以嵌合到堿基分子 能進(jìn)入正常細(xì)胞，凋亡細(xì)胞的胞核會(huì)呈致密濃染，或能進(jìn)入正常細(xì)胞，凋亡細(xì)胞的胞核會(huì)呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染呈碎塊狀致密濃染 凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞PI（Propidium Iodide, 碘化丙啶碘化丙啶 ） 是一種常用的細(xì)胞核熒光染色劑。是一種常用的細(xì)胞核熒光染色劑。 它它不能透過(guò)完整的細(xì)胞

26、膜不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在，但在凋亡中晚凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PIPI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而能夠透過(guò)細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染紅將細(xì)胞核染紅 將將Annexin-VAnnexin-V、HeochstHeochst與與PIPI匹配匹配使用，就使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來(lái)開來(lái)Heochst/PIHeochst/PI雙染雙染凋亡細(xì)胞膜通透性增高，凋亡細(xì)胞膜通透性增高，HoechstHoechst熒光（藍(lán)色）強(qiáng)度增高熒光（藍(lán)色）強(qiáng)度增高PIPI不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞中不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞中：正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞拒染，壞死細(xì)胞由：正

27、常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞拒染，壞死細(xì)胞由于失去膜完整性可染（紅色）。于失去膜完整性可染（紅色）。磷脂酰絲氨酸外翻分析（磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法） 磷脂酰絲氨酸（磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PSPhosphatidylserine, PS）在細(xì)胞凋亡的在細(xì)胞凋亡的早期可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面早期可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面 Annexin-VAnnexin-V是一種是一種Ca2 Ca2 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PSPS高親高親和力特異性結(jié)合。和力特異性結(jié)合。 將將Annexin-VAnnexin-V

28、進(jìn)行熒光素（進(jìn)行熒光素（FITCFITC）或）或biotinbiotin標(biāo)記，利用流標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Annexin V/PIAnnexin V/PI雙染色法雙染色法 8 8、細(xì)胞凋亡的流式分析、細(xì)胞凋亡的流式分析利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速、直線、流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對(duì)特定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。 流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）:流式細(xì)胞儀工作原理經(jīng)熒光染色的細(xì)胞從噴嘴中高速噴出，通過(guò)一個(gè)聚焦的光源進(jìn)而通過(guò)各種光敏元件測(cè)量這些細(xì)胞發(fā)射的散射光和熒光，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理得

29、到多種信息參數(shù)信號(hào)檢測(cè)-散射光 前散射光（前散射光（FSC)FSC)與細(xì)胞的大小有關(guān)與細(xì)胞的大小有關(guān)側(cè)散射光側(cè)散射光(SSC)(SSC)反映細(xì)胞內(nèi)的顆粒反映細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少多少信號(hào)檢測(cè)-熒光信號(hào) X X軸：代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)的強(qiáng)度，用軸：代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)的強(qiáng)度，用“通道數(shù)通道數(shù)”表示，表示，與光強(qiáng)度之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系與光強(qiáng)度之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系Y Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號(hào)特征性細(xì)胞的頻率軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號(hào)特征性細(xì)胞的頻率 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡常用的三種方法 （一）（一）PIPI單染色法單染色法（二）（二）Heochst 33342/PIHeochst 33342/PI雙染色法雙染色法（三）（三）Annexin V/PIAnnexin V/PI雙染色法雙染色法PI單染色法Heochst 33342/PI雙染色法 凋亡細(xì)胞膜通透性增高，Hoechst 33342熒光（藍(lán)色）強(qiáng)度增高 PI不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞中：正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞拒染，壞死細(xì)胞由于膜完整性可染（紅