PLGA_m_THPC納米型光敏劑的制備及其光動(dòng)力治療肝癌細(xì)

1、中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)（電子版）年月第卷第期（），納米型光敏劑的制備及其光動(dòng)力治療肝癌細(xì)胞的研究熊小強(qiáng)陳汝福汪峰江志鵬陳積圣周泉波基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（）；國(guó)家高科技計(jì)劃（）基金資助項(xiàng)目（）作者單位：廣州，中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科（熊小強(qiáng)）；中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科（陳汝福、江志鵬、陳積圣、周泉波）；廣州，廣州醫(yī)學(xué)院物理教研室（汪峰）通訊作者：周泉波，電子郵箱：【摘要】目的制備聚乳酸一羥基乙酸共聚物（，）包裹四（間羥基苯基）二氫卟吩（），的納米型光敏劑，在體外研究其對(duì)人肝癌細(xì)胞光動(dòng)力治療（，）作用。方法采用的方法制備納米微球，掃描電子顯微鏡下檢測(cè)其粒徑大小。熒光光譜儀檢測(cè)其在含胎牛

2、血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中的吸收光譜。在人肝癌細(xì)胞株細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)，分別加入不同濃度的，加紅光照射后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法測(cè)定細(xì)胞的存活率。結(jié)果納米顆粒平均直徑為。在含血清培養(yǎng)液中的吸收光譜圖顯示其在處有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，并隨著時(shí)間的推移吸光度增強(qiáng)。進(jìn)入細(xì)胞主要聚集在胞漿，其對(duì)細(xì)胞的光敏殺傷作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。結(jié)論具有緩釋、生物相容性好及光毒性低等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的光敏劑?！娟P(guān)鍵詞】納米微球納米技術(shù)；光敏感劑；四（間羥基苯基）二氫卟吩；光動(dòng)力療法；聚乳酸羥基乙酸共聚物Production of PLGA-m-THPC nanoparticles and it s photodyna

3、mic therapy on human hepatic can cer cell XIONG Xiao-qiang, CHEN Ru-fu, WANG Feng, JIANG Zhi-peng, CHEN Ji-sheng, ZHOU Quan-bo *. *Department of Hepatobiliary Surgery,The Second Affiliated Hospital of SUN Yat -sen University,Guangzhou 510120, ChinaCorresponding author:ZHOU Quan-bo,E-mail:hnhszqb【Abs

4、tract 】Objective （）（）（）Methods （），Results Conclusion ，【Key Words 】；論著光動(dòng)力治療（，）作為治療腫瘤的一種新方法，已引起醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注，光敏劑作為發(fā)揮作用的載體一直是提高其療效的核心問題之一。然而，第一、二代光敏劑受到其光毒性、體內(nèi)靶向性差等因素影響，使其在臨床上應(yīng)用受到限制。本研究選擇聚乳酸羥基乙酸共聚物（中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)（電子版）年月第卷第期（），）作為光敏劑四（間羥基苯基）二氫卟吩（），的載體材料，應(yīng)用的方法制備納米型光敏劑，并研究其光動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)及在體外光動(dòng)力治療肝癌的效果。材料和方法一、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑高速分散均質(zhì)機(jī)（

5、上海標(biāo)本模型廠），型超級(jí)恒溫溫水浴，（重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），臺(tái)式離心機(jī)（）（上海安亭科學(xué)儀器廠），懸臂式攪拌機(jī)（，廣州儀科實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司），真空干燥箱（，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），半導(dǎo)體激光器（波長(zhǎng)，輸出功率，中山大學(xué)物理系研制），型吸收光譜儀（公司），熒光分光光度計(jì)（日本島津），激光共聚焦顯微鏡（日本），電子顯微鏡（日本電子公司），聚乙烯醇（公司），聚乳酸聚羥基乙酸（：，公司），由南京光電研究所制備。肝癌細(xì)胞株細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。二、的制備及粒徑檢測(cè)納米微球采用的方法制備。實(shí)驗(yàn)過程為：首先將和溶入二氯甲烷和甲醇的混和溶液中（體積比：）超聲，然后將其滴入到含表面活性劑的水溶液中，攪拌揮發(fā)有機(jī)溶

6、劑后，用離心機(jī)離心（）即得聚乳酸聚羥基乙酸載藥光敏劑納米微球。場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，工作電壓為，用來分析顆粒形貌。測(cè)試時(shí)取納米顆粒先用去離子水離心清洗次，用超聲分散，然后用滴管取少量滴在干凈的鍍金硅片上，室溫干燥后表面噴金，再放入真空干燥箱中干燥，然后進(jìn)行掃描電鏡（）觀察。三、藥物載藥量和包封率的測(cè)量載藥量微球中的光敏劑微球的重量；包封率微球中的光敏劑投藥量。測(cè)量方法：稱取適量的，配置好不同濃度的有機(jī)溶液份，在處測(cè)其吸光度，得到吸光度和溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后準(zhǔn)確稱取的納米微球溶于二氯甲烷和甲醇混合有機(jī)溶劑中，完全溶解后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在處的吸收值，然后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其濃度，并根據(jù)公式

7、計(jì)算出微球中的載藥量和包封率；剩下的顆粒分別去水干燥后，稱量它們的質(zhì)量。四、納米微粒的熒光光譜測(cè)定先稱取一定量的納米微粒溶于不含血清的培養(yǎng)液中，輕輕攪拌后配成高濃度的溶液，然后用微量注射器取適量緩慢加入到含胎牛血清培養(yǎng)液中，并同時(shí)攪拌，配置成含的細(xì)胞培養(yǎng)液。然后采用熒光光譜儀檢測(cè)在含血清培養(yǎng)液中的紫外吸收光譜。五、體外光動(dòng)力治療實(shí)驗(yàn)共分組，分別為激光照射的實(shí)驗(yàn)組（濃度分別為、）、單純（）組（對(duì)照組）及未加光敏劑的激光照射組（對(duì)照組）。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肝癌細(xì)胞株細(xì)胞按個(gè)密度接種于培養(yǎng)板中（需預(yù)置蓋玻片），待其貼壁后，吸出含血清培養(yǎng)液后，液輕輕漂洗后棄去，于暗室中加入含不同濃度的（）的培養(yǎng)液孵育，棄

8、去含光敏劑之培養(yǎng)液，液清洗后，加入新鮮培養(yǎng)液，然后進(jìn)行光敏作用試驗(yàn)。將上述對(duì)照組加入后不用紅光照射，細(xì)胞在的溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)（、）用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光分布，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞采用紅光（激發(fā)波長(zhǎng)），以功率照射后，細(xì)胞在的溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)或，然后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。將紅光照射后的細(xì)胞用的胰酶消化后，以的錐蟲藍(lán)染色，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)含有不同濃度組的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)不同條件下的細(xì)胞存活數(shù)，比較不同濃度下的殺傷效果。中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)（電子版）年月第卷第期（）， 圖電子掃描電鏡下顆粒的微觀形態(tài)，平均粒徑左右（） 圖納米型光敏劑（）在含血清

9、的細(xì)胞培養(yǎng)液中的吸收光譜圖結(jié)果一、納米顆粒的形態(tài)及直徑納米顆粒在掃描電鏡下呈典型的球形，大小較均勻，表面光滑，分散性良好（圖）。高倍掃描電鏡顯示納米顆粒呈核殼型結(jié)構(gòu)。動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定其粒徑為（），粒徑分布范圍較窄，以上納米微粒直徑在范圍之內(nèi)。二、納米顆粒根據(jù)公式算出納米顆粒的載藥量為（），包封率為（）。三、血漿中的吸收光譜學(xué)特征圖為加到培養(yǎng)液（含胎牛血清）后，在不同時(shí)間點(diǎn)熒光光譜儀檢測(cè)到的紫外吸收光譜。其結(jié)果顯示在處有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，并隨著時(shí)間的推移，此峰的吸光度逐漸增強(qiáng)。中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)（電子版）年月第卷第期（），四、激光共聚焦顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)熒光分布對(duì)照組體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示在進(jìn)入細(xì)胞和的胞

10、內(nèi)分布情況（圖）。在時(shí)，可見熒光主要聚集在胞膜周圍，隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)，可見光敏劑主要以顆粒狀熒光分布在胞漿，胞膜周圍熒光減弱，而在核內(nèi)分布很少。五、經(jīng)激光照射后對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用在倒置顯微鏡下，對(duì)照組、的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞輪廓清晰，與正常細(xì)胞無明顯差別。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用紅光照射后，可以觀察到細(xì)胞有不同程度脫落，細(xì)胞形態(tài)有改變。實(shí)驗(yàn)組中的濃度為的大多細(xì)胞仍貼壁，有少量脫落，細(xì)胞輪廓清楚，但有圓縮趨勢(shì)；濃度為和的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞大部分細(xì)胞明顯圓縮變性，細(xì)胞界限模糊不清，尚有少數(shù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，在細(xì)胞表面有各種泡狀突起，培養(yǎng)液中有大量成片細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞漂??；濃度為時(shí)細(xì)胞基本全部壞死，脫壁呈懸浮狀。討論四（間羥基

11、苯基）二氫卟吩（），是第二代光敏劑，以其強(qiáng)大的光敏活性（較第一代光敏劑血卟啉衍生物即高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)）和較低的毒性得到了臨床的認(rèn)可，年月被批準(zhǔn)在歐洲上市。然而仍存在一些缺陷，：水溶性差：水溶液中以不發(fā)熒光的聚集體存在；體內(nèi)靶向性分布仍需要提高；仍需要進(jìn)一步減低其治療后的光毒性，這些因素均影響了其在機(jī)體內(nèi)的應(yīng)用。因此，如果能采用化學(xué)或物理修飾方法改變的光學(xué)活性，提高其細(xì)胞和組織的靶向能力，這將有利于在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮更好的殺滅腫瘤作用。是生物可降解高分子材料，具有良好的可降解性能以及生物相容性，已應(yīng)用于藥物控制釋放的載體和組織工程的支架材料。最近有研究表明包裹的二氫卟吩類光敏劑受激光照射激發(fā)后，二氫卟吩

12、的生色基團(tuán)幾乎完全淬滅而不能產(chǎn)生熒光和光毒性，這將有利于保護(hù)光敏劑在體內(nèi)循環(huán)中的安全性和光學(xué)穩(wěn)定性。本研究結(jié)果也表明在含胎牛血清的培養(yǎng)液中，的熒光活性有時(shí)間依賴性，在孵育以內(nèi)，的熒光活性很低。隨時(shí)間的推移，的熒光活性逐漸增強(qiáng)，這證明了在血漿中具有光敏劑的緩釋作用。因此，這種劑型光敏劑能有效預(yù)防光線刺激，同時(shí)在血液系統(tǒng)中運(yùn)輸時(shí)沒有毒副作用。但當(dāng)納米微粒運(yùn)至腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)溶酶體等的作用下使裂解并釋放，如果此時(shí)配合光線外照射光敏劑，則能有效殺滅腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用熒光顯微鏡觀察到進(jìn)入細(xì)胞后，主要以顆粒狀熒光分布在胞漿，胞膜周圍熒光減弱，而在核內(nèi)分布很少。 在細(xì)胞內(nèi)顆粒狀熒光特征在一定程度上表明了

13、這種光敏劑在圖肝癌細(xì)胞株在含（）溶液中孵育（左）和（右）后，細(xì)胞在共聚焦熒光顯微鏡下觀察結(jié)果中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)（電子版）年月第卷第期（），線粒體和胞內(nèi)體或溶酶體的分布，不同濃度的光敏劑孵育細(xì)胞可產(chǎn)生不同的熒光強(qiáng)度，但胞內(nèi)分布沒有明顯不同。這與的光動(dòng)力治療腫瘤的機(jī)制一致，主要集中于細(xì)胞的線粒體中，當(dāng)含有光敏劑的線粒體接受光照后，即發(fā)生光動(dòng)力損傷。由于線粒體的受損而直接或間接地影響其參與呼吸、電子傳遞和能量合成等生命活動(dòng)所必需的酶活性和呼吸鏈的完整性，從而破壞細(xì)胞的正常生命活動(dòng)和造成細(xì)胞的損傷。體外光動(dòng)力殺傷腫瘤細(xì)胞的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組（濃度為時(shí)）加紅光照射后肝癌細(xì)胞基本全部壞死。而對(duì)照組單純光敏劑或單純的紅光照射均不能殺死肝癌細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)也沒有明顯的影響。這表明了包裹后并沒有改變其光學(xué)活性，在紅光照射后仍能維持較強(qiáng)的殺腫瘤細(xì)胞作用。因此，我們認(rèn)為利用納米材料包裹后，能提高的水溶性及生物利用度，減少了在血液運(yùn)輸中的丟失光動(dòng)力學(xué)活性，增加其