高滲刺激誘導(dǎo)大鼠下丘腦室旁核和視上核神經(jīng)激肽B受體陽性神經(jīng)元

1、    高滲刺激誘導(dǎo)大鼠下丘腦室旁核和視上核神經(jīng)激肽B受體陽性神經(jīng)元表達(dá)Fos呂葆真丁玉強(qiáng) 【摘要】目的研究神經(jīng)激肽B受體(NK3受體)與機(jī)體滲透壓調(diào)節(jié)之間的可能關(guān)系。方法用雙重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，高滲刺激采用靜脈內(nèi)注射1.5 mol/L NaCl的方法，觀察了下丘腦室旁核和視上核內(nèi)NK3受體陽性神經(jīng)元在高滲刺激下的Fos表達(dá)情況。結(jié)果高滲鹽水可誘導(dǎo)下丘腦室旁核和視上核內(nèi)大量神經(jīng)元表達(dá)Fos。在室旁核，雙標(biāo)細(xì)胞約占NK3受體陽性神經(jīng)元的88%，約占Fos陽性細(xì)胞的71%；在視上核的主部，雙標(biāo)細(xì)胞約占NK3受體陽性神經(jīng)元的74%，約占Fos陽性細(xì)胞的43

2、%。結(jié)論室旁核和視上核內(nèi)NK3受體陽性神經(jīng)元可能參與大鼠滲透壓調(diào)節(jié)過程。 【關(guān)鍵詞】神經(jīng)激肽B受體Fos下丘腦室旁核視上核大鼠 NEUROKININ B RECEPTOR-POSITIVE NEURONS IN THE PARAVENTRICULAR AND SUPRAOPTIC NUCLEI OF THE HYPOTHALAMUS EXPRESS Fos AFTER INTRA- VENOUS INJECTION OF HYPERTONIC SALINE IN THE RAT Baozhen, Ding Yuqiang (Department of Anatomy and K.K.Leung

3、 Brain Research Center, The Fourth Military Medical University,Xi'an) 【Abstract】 Objective In order to investigate possible relation of neurokinin B receptor(NK3) with osmoregulation,expression of Fos in NK3 receptor-containing neurons in the paraventricular and supraoptic nuclei of the hypothal

4、amus was investigated in the rat after hypertonic stimuli.Methods A double immunohistochemical staining method was used;hypertonic stimuli was done with intravenous injection of 1.5 mol/L NaCl.Results Hypertonic treatment induced Fos expression in many neurons of the paraventricular and supraoptic n

5、uclei.In the paraventricular nucleus,about 88% of NK3 receptor-positive neurons exhibited Fos-like immunoreactivity, which corresponded to about 71% of Fos-positive neurons.In the principal part of the supraoptic nucleus,about 74% of NK3 receptor-positive neurons was Fos-like immunoreactive,which co

6、rresponded to about 43% of Fos-positive neurons.Conclusion NK3 receptor-containing neurons in the paraventricular and supraoptic nuclei might be involved in osmoregulation of the rat. 【Key words】 Neurokinin B receptor; Fos; Hypothalamic paraventricular nucleus; Supraoptic nucleus; Rat 速激肽家族主要包括P物質(zhì)、K

7、物質(zhì)(又稱神經(jīng)激肽A)和神經(jīng)激肽B(neurokinin B,NKB),它們在神經(jīng)系統(tǒng)的功能活動中起著重要的作用1。速激肽的生理作用是通過它們各自相應(yīng)的受體實(shí)現(xiàn)的，即NK1、NK2和NK3受體2，3。以往的研究表明，NKB/NK3受體在機(jī)體水鹽代謝和滲透壓調(diào)節(jié)中起著重要的作用。如腦室內(nèi)注射NKB或NK3受體的激動劑可引起動物血壓升高并抑制對鹽的攝取，同時可引起下丘腦釋放加壓素46。c-fos作為即刻早期基因家族的成員，它的表達(dá)常被認(rèn)為是神經(jīng)元被激活的標(biāo)記而廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)的研究領(lǐng)域。以往文獻(xiàn)證實(shí)，靜脈內(nèi)注射高滲鹽水可使機(jī)體處于高滲環(huán)境并可誘導(dǎo)下丘腦室旁核和視上核等與滲透壓調(diào)節(jié)有關(guān)的腦區(qū)表達(dá)c

8、-fos7，8，說明c-fos表達(dá)亦可應(yīng)用于滲透壓調(diào)節(jié)神經(jīng)通路的研究。因此，為研究下丘腦室旁核和視上核NK3受體與機(jī)體滲透壓調(diào)節(jié)之間的關(guān)系，本研究采用免疫雙標(biāo)記技術(shù)，觀察了高滲條件刺激下大鼠下丘腦室旁核和視上核內(nèi)NK3受體陽性神經(jīng)元的Fos表達(dá)情況。 材料和方法 實(shí)驗(yàn)共用成年SD大鼠6只。在腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉下，將含有0.9%肝素的塑料管插入頸外靜脈并用絲線固定，該管在皮下沿頸部繞至大鼠的背部。動物存活3d后，通過塑料管將等滲的0.15 mol/L的生理鹽水(2只)或1.5 mol/L的高滲鹽水(4只)緩慢注入頸外靜脈(5.5 ml/kg)7。在操作過程中，動物處于自

9、由活動狀態(tài)，未見明顯不適反應(yīng)。90 min后，在腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)的深麻醉狀態(tài)下，開胸經(jīng)升主動脈插管，先用100ml生理鹽水沖凈血液，然后用500 ml含4%的多聚甲醛和0.5%的苦味酸的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH7.4)灌注固定，灌畢取全腦，然后置于含有30%的蔗糖的0.1 mol/L PB(pH7.4)過夜。取含下丘腦的腦塊，冰凍冠狀切片，片厚15 m。切片先用PAP法進(jìn)行NK3受體免疫組織化學(xué)反應(yīng)，然后用ABC法進(jìn)行Fos免疫組織化學(xué)反應(yīng)。切片經(jīng)0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)漂洗后，依次進(jìn)入兔抗大鼠NK3受體多克隆抗體(0.8

10、 g/ml，關(guān)于此抗體的制備和鑒定請參照文獻(xiàn)9)孵育過夜；羊抗兔IgG(Vector,150)4h；PAP復(fù)合物(Sigma,1100)2h。其中一抗和二抗用含1%的正常驢血清和0.3%的Triton X-100的0.01 mol/L PBS(pH7.4)稀釋，PAP復(fù)合物用含0.3%的Triton X-100的0.01mol/L PBS(pH7.4)稀釋。切片最后在含有0.05%DAB和0.003%的H2O2的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.6)內(nèi)呈色2030 min。NK3受體免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色。免疫染色后的切片經(jīng)0.01 mol/L PBS(pH7.4)漂洗30

11、min，然后用ABC法進(jìn)行Fos免疫組織化學(xué)染色。切片首先進(jìn)入羊抗Fos血清(Cambridge,13 000)孵育過夜，然后依次進(jìn)入生物素標(biāo)記的驢抗羊IgG(Jackson,1100)2h和ABC復(fù)合物(Vector,150)1h。最后切片經(jīng)H2O2/DAB/硫酸鎳胺呈色，F(xiàn)os陽性胞核為黑色。 對照實(shí)驗(yàn)在省略一抗、或用正常兔血清代替兔抗NK3受體抗體、或用羊血清代替羊抗Fos血清的情況下進(jìn)行，結(jié)果為陰性。 結(jié)果 在注射0.15 mol/L等滲生理鹽水的大鼠，有一定數(shù)量的Fos陽性神經(jīng)元恒定出現(xiàn)于大腦皮質(zhì)(包括梨狀皮質(zhì)、運(yùn)動和感覺皮質(zhì))、下丘腦的視前區(qū)、下丘腦外側(cè)區(qū)和丘腦室旁核。視上核的主部

12、內(nèi)有個別散在分布且染色淺淡的Fos陽性細(xì)胞(3個細(xì)胞/切片)，但下丘腦室旁核、視上核的視交叉后部及下丘腦的其他區(qū)域?yàn)殛幮浴＝o予高滲刺激大鼠的Fos免疫染色發(fā)現(xiàn)，除大腦皮質(zhì)和下丘腦視前區(qū)等腦區(qū)外，大量濃染的Fos陽性細(xì)胞出現(xiàn)于下丘腦的室旁核和視上核內(nèi)。Fos陽性細(xì)胞主要位于室旁核的后大細(xì)胞部和視上核的主部，少量散在分布于視上核視交叉后部和室旁核的小細(xì)胞部。此外，還有一定數(shù)量聚集成團(tuán)的Fos陽性細(xì)胞出現(xiàn)于下丘腦前部的圓形核和血管周圍。 與我們9，10先前的研究結(jié)果一致，NK3受體免疫陽性反應(yīng)神經(jīng)元廣泛分布于大鼠下丘腦內(nèi)。在室旁核和視上核，NK3受體陽性神經(jīng)元主要見于室旁核的后大細(xì)胞部和視上核的主部

13、。免疫雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，NK3受體陽性神經(jīng)元與Fos陽性神經(jīng)元在下丘腦室旁核和視上核呈重疊分布，即NK3受體陽性神經(jīng)元與Fos樣陽性神經(jīng)元均主要位于室旁核的后大細(xì)胞部和視上核的主部，并有相當(dāng)數(shù)量的NK3受體同時為Fos陽性(圖AD)。Fos免疫反應(yīng)產(chǎn)物定位于神經(jīng)元的胞核內(nèi)，呈黑色，而NK3受體陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要位于胞膜下，呈黃褐色，兩者易于區(qū)分。在室旁核的后大細(xì)胞部，大約有88%(127/144)的NK3受體陽性神經(jīng)元表達(dá)Fos，占Fos陽性神經(jīng)元的71%(127/180)(圖A)。在視上核的主部，NK3受體/Fos雙標(biāo)細(xì)胞占NK3受體陽性神經(jīng)元的74%(76/103)，占Fos陽性神經(jīng)元的43

14、%(76/176)(圖C)。此外，在室旁核的小細(xì)胞部(圖B)、視上核的視交叉后部(圖D)和下丘腦前部的圓形核(圖E)和血管周(圖F)也分布有少量NK3受體/Fos雙標(biāo)細(xì)胞。在下丘腦的其他區(qū)域未見有NK3受體/Fos雙標(biāo)細(xì)胞出現(xiàn)。 討論 以往的研究表明，通過腹腔內(nèi)注射、皮下注射或靜脈內(nèi)注射高滲鹽水可使動物血漿內(nèi)鈉濃度升高而處于高滲環(huán)境，并可誘導(dǎo)下丘腦視上核和室旁核等與滲透壓調(diào)節(jié)有關(guān)的腦區(qū)表達(dá)Fos7，8。但采用腹腔內(nèi)或皮下注射的方法?？梢饎游锂a(chǎn)生痛反應(yīng)，并可引起下丘腦室旁核小細(xì)胞部的神經(jīng)元表達(dá)Fos，而下丘腦室旁核小細(xì)胞部神經(jīng)元表達(dá)Fos被認(rèn)為是與動物應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)11。故本實(shí)驗(yàn)采用靜脈內(nèi)插管然

15、后通過插管注入高滲鹽水的方法給予動物高滲刺激。盡管如此，在本實(shí)驗(yàn)條件下，下丘腦室旁核小細(xì)胞部內(nèi)仍有少量神經(jīng)元表達(dá)Fos。這可能是由于注射高滲鹽水的速度不恒定而使動物產(chǎn)生痛反應(yīng)引起的，因?yàn)樵诓捎脵C(jī)械恒速緩慢注射生理鹽水時，室旁核小細(xì)胞部內(nèi)只有個別神經(jīng)元表達(dá)Fos7。 眾所周知，下丘腦室旁核和視上核合成加壓素并通過視上垂體束釋放至垂體后葉的血管而發(fā)揮其調(diào)節(jié)機(jī)體滲透壓的作用。我們以往的研究表明，大鼠下丘腦室旁核和視上核含有大量NK3受體陽性神經(jīng)元，它們主要位于室旁核的后大細(xì)胞部和視上核的主部，且約有半數(shù)的NK3受體陽性神經(jīng)元含有加壓素9，10。藥理學(xué)和生理學(xué)研究表明，腦室內(nèi)注射NKB或NK3受體的激

16、動劑可抑制動物的鹽欲，并可引起動物血壓升高、心率加快等類似加壓素的生理效應(yīng)5，6。后來的研究證實(shí)這種效應(yīng)就是通過下丘腦釋放加壓素實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)檫@種效應(yīng)可被加壓素受體阻斷劑阻斷，且動物血漿內(nèi)加壓素的含量在給予NKB或NK3受體的激動劑后升高4，5，12，13。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠下丘腦室旁核的后大細(xì)胞部和視上核的主部內(nèi)約有3/4的NK3受體陽性神經(jīng)元為Fos陽性，提示高滲刺激可激活室旁核和視上核內(nèi)的NK3受體陽性神經(jīng)元。綜上，可以認(rèn)為下丘腦室旁核和視上核內(nèi)NK3受體陽性神經(jīng)元可能通過調(diào)節(jié)加壓素的釋放而參與機(jī)體滲透壓的調(diào)節(jié)過程。 圖AF示靜脈注射高滲鹽水后，大鼠下丘腦室旁核后大細(xì)胞部(圖A)、室旁核小細(xì)胞

17、部(圖B)、視上核主部(圖C)、視上核視交叉后部(圖D)、圓形核(圖E)和血管周(圖F)內(nèi)的NK3受體陽性神經(jīng)元表達(dá)Fos。三角箭頭示部分雙標(biāo)細(xì)胞，大箭頭示部分Fos單標(biāo)細(xì)胞，小箭頭示部分NKR單標(biāo)細(xì)胞。圖C和圖F中的星號示血管。標(biāo)尺示30 m Figs.A-F Showing NK3 receptor-positive neurons expressed Fos-LI in the posterior magnocellular part of the paraventricular nucleus(Fig.A),parveocellular part of the paraventricu

18、lar nucleus(Fig.B),principal part of the supraoptic nucleus(Fig.C),retrochiasmatic part of the supraoptic nucleus(Fig.D),circular nucleus(Fig.E), and the region around blood vessels(Fig.F) in the rat hypothalamus following intravenous injection of hypertonic saline.A part of double-labeled neurons a

19、re indicated by triangles.Large and small arrowheads indicated Fos-and NKR-single-labeled neurons,respectively.Note that blood vessels in Fig.C and Fig.F are indicated by stars.Bar=30 m * 國家自然科學(xué)基金資助課題(No.39600045) Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Center,The Fourth Military Medical

20、University,Xi'an 710032,China 作者單位:呂葆真丁玉強(qiáng)(第四軍醫(yī)大學(xué)解剖學(xué)教研室，梁鋸腦研究中心，西安710032) 參考文獻(xiàn) 1Otsuka M,Yoshioka K.Neurotransmitter functions of mammalian tachykinins.Physiol Rev,1993,73(2):229 2Maggio JE.Tachykinins.Annu Rev Neurosci,1988,11(1):13 3Nakanishi S.Mammalian tachykinin receptors.Annu Rev Neurosci,1

21、991,14(1):123 4Cantalamessae F,De Caro G,Massi M,et al.Possible influence of tachykinins on body fluid homeostasis in the rat.J Physiol(Paris),1984,79(2):524 5De Caro G,Perfumi M,Massi M.Progress in Psychobiology and Physiological Psychology,vol 13,New York:Academic Press,1988:31-61 6Massi M,Polidor

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