十一章節(jié)生物素親合素放大技術(shù)

1、十一章節(jié)生物素親合素放大技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標記親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標記一、理化特性一、理化特性二、親合素（或鏈酶親合素）的標記二、親合素（或鏈酶親合素）的標記第一節(jié)第一節(jié) 生物素的理化性質(zhì)與標記生物素的理化性質(zhì)與標記一、活化生物素一、活化生物素二、活化生物素標記蛋白質(zhì)二、活化生物素標記蛋白質(zhì)第三節(jié)第三節(jié) 生物素生物素- -親合素系統(tǒng)的特點親合素系統(tǒng)的特點一、靈敏度一、靈敏度二、特異性二、特異性三、穩(wěn)定性三、穩(wěn)定性四、適用性四、適用性五、其他五、其他思考題思考題小結(jié)小結(jié)第四節(jié)第四節(jié) 生物素生物素- -親合素系統(tǒng)的應用親合素系統(tǒng)的應用一、生物素一、生物素-

2、-親合素系統(tǒng)基本類型及原理親合素系統(tǒng)基本類型及原理二、生物素二、生物素- -親合素系統(tǒng)在酶免疫測定中的應用親合素系統(tǒng)在酶免疫測定中的應用三、生物素三、生物素- -親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應用親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應用四、生物素四、生物素- -親合素系統(tǒng)在放射免疫測定中的應用親合素系統(tǒng)在放射免疫測定中的應用五、生物素五、生物素- -親合素系統(tǒng)在分子生物學中的應用親合素系統(tǒng)在分子生物學中的應用維生素維生素H H 動、植物組織中廣泛動、植物組織中廣泛 分布分布, ,卵黃和肝含量高卵黃和肝含量高MW 244.31kD.MW 244.31kD.I I環(huán)為咪唑酮環(huán)，可與親合環(huán)為咪唑酮環(huán)，可與親合

3、 素結(jié)合素結(jié)合環(huán)為噻吩環(huán)，環(huán)為噻吩環(huán)，C2C2上戊酸上戊酸 側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生 物大分子的唯一結(jié)構(gòu)物大分子的唯一結(jié)構(gòu) 羧基羧基第一節(jié)第一節(jié) 生物素理化性質(zhì)與標記生物素理化性質(zhì)與標記一、活化生物素一、活化生物素 生物素側(cè)鏈的末生物素側(cè)鏈的末端羧基經(jīng)化學修端羧基經(jīng)化學修飾后制成帶各種飾后制成帶各種活性基團的衍生活性基團的衍生物活化生物素物活化生物素( (生物素化衍生物生物素化衍生物) )生物素活化生物素活化活化生物素易活化生物素易與抗原、抗體與抗原、抗體酶及核酸分子酶及核酸分子中相應基團偶中相應基團偶聯(lián)形成生物素聯(lián)形成生物素化標記物化標記物 標記蛋白質(zhì)標記蛋白質(zhì)氨基氨基的

4、活化生物素的活化生物素 標記蛋白質(zhì)標記蛋白質(zhì)醛基醛基的活化生物素的活化生物素 標記蛋白質(zhì)標記蛋白質(zhì)巰基巰基的活化生物素的活化生物素 標記標記核酸核酸的活化生物素的活化生物素 活化生物素活化生物素標記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素標記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素BNHSBNHS分子可與蛋白質(zhì)分子可與蛋白質(zhì) 賴氨酸的氨基形成肽鍵賴氨酸的氨基形成肽鍵 BNHSBNHS適用標記抗體和適用標記抗體和 中性或偏堿性的蛋白質(zhì)中性或偏堿性的蛋白質(zhì)生物素生物素N-N-羥基丁二酰胺羥基丁二酰胺生物素羥生物素羥基琥珀?；牾啺孵ィ▉啺孵ィ˙NHS BNHS ）如何減小空間位阻？如何減小空間位阻？長臂活化生物素長臂活化生物素（

5、BCNHSBCNHS）：）：生物素和生物素和N-N-羥基丁二酰亞胺之間添羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個加了兩個6-6-氨基已糖分子基團，形氨基已糖分子基團，形成連結(jié)臂，生物素與大分子基團的成連結(jié)臂，生物素與大分子基團的距離距離 標記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素標記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素生物素酰肼生物素酰肼(BHZ)(BHZ)：水合肼與生物素的合成物：水合肼與生物素的合成物 主要用于標記偏酸性糖蛋白主要用于標記偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素肼化生物胞素(BCHZ) (BCHZ) ：生物素與賴氨酸連接：生物素與賴氨酸連接 后，再與無水肼反應而成。后，再與無水肼反應而成。 除醛基外，除醛基外， BCHZBCHZ

6、還可標記氨基還可標記氨基標記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素標記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素馬來酰亞胺馬來酰亞胺- -丙酰丙酰- -生物胞素（生物胞素（MPB)MPB)能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化生物素生物素 標記核酸的活化生物素標記核酸的活化生物素光生物素光生物素(photobiotin)(photobiotin) 側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團, , 經(jīng)光照后經(jīng)光照后, , 變?yōu)樽優(yōu)榉枷惴枷?基硝基苯，可直接與腺嘌呤氨基結(jié)合基硝基苯，可直接與腺嘌呤氨基結(jié)合, , 形成形成B-B-核酸核酸探針探針 生物素脫氧核苷三磷酸生物素脫氧核苷三磷酸（Bio-d

7、UTP） 作為作為TTPTTP的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移 位法摻入到雙鏈位法摻入到雙鏈DNADNA中。中。BNHS和和BHZ 可直接標記核酸，可直接標記核酸，但對但對堿基配對堿基配對有影有影響。響。 活化生物素通過側(cè)鏈與蛋白分子連接；活化生物素通過側(cè)鏈與蛋白分子連接； 一個蛋白分子可被多個生物素標記多價性；一個蛋白分子可被多個生物素標記多價性； 對對BNHS多標記抗體多標記抗體, BHZ則多標記微酸性抗原；則多標記微酸性抗原； 抗原、抗體標記后活性不變；抗原、抗體標記后活性不變； 可對標記材料（如酶）標記：堿性磷酸酶標記后可對標記材料（如酶）標記：堿性磷酸酶標記后 活

8、性將降低；活性將降低；二、生物素標記蛋白質(zhì)二、生物素標記蛋白質(zhì) 選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標記基團選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標記基團 的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性； 控制生物素：蛋白質(zhì)比例控制生物素：蛋白質(zhì)比例 生物素：生物素：IgG IgG 用量比用量比(mg/mg)宜為宜為2:1, IgG2:1, IgG應用濃度應用濃度 5 5g/ml; 生物素生物素1 13 3個個/Ag/Ag，3 35 5個個/Ab/Ab； 使用交聯(lián)臂減少空間阻力使用交聯(lián)臂減少空間阻力第二節(jié)第二節(jié) 親合素、鏈霉親合素的理親合素、鏈霉親合素

9、的理化性質(zhì)與標記化性質(zhì)與標記親合素親合素(avidin, AV) 和鏈霉親合素和鏈霉親合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特異性結(jié)合是生物素的天然特異性結(jié)合物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標記的物質(zhì)均可以同親合素（有用于標記的物質(zhì)均可以同親合素（AV）或鏈）或鏈酶親合素（酶親合素（SA）結(jié)合。）結(jié)合。 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 四亞基糖蛋白四亞基糖蛋白 四肽鏈蛋白四肽鏈蛋白 無糖基無糖基PI PI 10.5 610.5 6結(jié)合位結(jié)合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 44 4Ka 10Ka 1015 15 10 101515活

10、性活性 131315 1515 151818一、理一、理 化化 特特 性性二、親合素二、親合素/鏈霉親合素標記鏈霉親合素標記 標記物：酶、膠體金標記物：酶、膠體金 異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITC） HRP-AV(SA) 過碘酸鈉、戊二醛過碘酸鈉、戊二醛 ABC/SABC 預制預制AV(SAV)-Biotin第三節(jié)第三節(jié) 生物素生物素- -親合素系統(tǒng)的特點親合素系統(tǒng)的特點一、靈敏度一、靈敏度二、特異性二、特異性三、穩(wěn)定性三、穩(wěn)定性四、適用性四、適用性五、其他五、其他第四節(jié)第四節(jié) 生物素生物素- -親合素系統(tǒng)的應親合素系統(tǒng)的應用用生物素與親合素之間結(jié)合的親合生物素與親合素之間結(jié)合的親合力

11、高、特異性強，各自均可以與各型力高、特異性強，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應時具有的多級放大作用等優(yōu)越性，使時具有的多級放大作用等優(yōu)越性，使BASBAS及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應用在各種標及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應用在各種標記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標記記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標記免疫檢測自動化分析做出了極大的貢免疫檢測自動化分析做出了極大的貢獻。獻。 一、生物素一、生物素- -親合素系統(tǒng)基本類型親合素系統(tǒng)基本類型及原理及原理BABBAB法：法： Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A A Ag-Ab Ag-AbB-A B-A B

12、 BE E Ag-Ab Ag-AbB-A-BB-A-BE E 特點：以游離特點：以游離A A分別連接分別連接B-AbB-Ab和和B-E B-E BABA法法Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A AE E Ag-Ab Ag-AbB-A-BB-A-BE E特點：以特點：以A-E/SA-EA-E/SA-E代替代替BABBAB法中的法中的A A，省，省 卻了加卻了加B-EB-E的步驟的步驟3. 3. ABC ABC法法 A+BA+BE A- BE A- BE-ABCE-ABC Ag+B Ag+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B ABCABC Ag-Ab Ag-AbB-ABC

13、 B-ABC 特點特點: :將將BABBAB法中的法中的A A先與先與B-EB-E結(jié)合，制備成復合物結(jié)合，制備成復合物ABCABC二、生物素二、生物素- -親合素系統(tǒng)在酶免疫親合素系統(tǒng)在酶免疫測定中的應用測定中的應用BASBAS在在ELISAELISA中的應用中的應用 生物素生物素- -親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測定親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測定 三、生物素三、生物素- -親合素系統(tǒng)在熒光免親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應用疫技術(shù)中的應用 BAS BAS用于熒光抗體技術(shù)，通常采用用于熒光抗體技術(shù)，通常采用BABA法，法，即用熒光素直接標記親合素（或鏈酶親即用熒光素直接標記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用

14、游離親合素（或鏈酶合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標記的生物素（抗體和熒光素標記的生物素（BABBAB法）或法）或熒光標記的抗親合素（或鏈酶親合素）熒光標記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法?？贵w的夾心法。 四、生物素四、生物素- -親合素系統(tǒng)在放射免親合素系統(tǒng)在放射免疫測定中的應用疫測定中的應用BASBAS主要與免疫放射分析主要與免疫放射分析(IRMA)(IRMA)檢測體系偶檢測體系偶聯(lián)，用于對終反應的放大（聯(lián)，用于對終反應的放大（BABA法）法） BASBAS也可用于也可用于IRMAIRMA反應后反應后B

15、 B、F F成分的分離成分的分離 五、生物素五、生物素- -親合素系統(tǒng)在分子生親合素系統(tǒng)在分子生物學中的應用物學中的應用以生物素標記核酸探針進行的定位檢測以生物素標記核酸探針進行的定位檢測用用BAS制備的親和吸附劑進行基因的分離制備的親和吸附劑進行基因的分離純化純化將免疫測定技術(shù)與將免疫測定技術(shù)與PCR結(jié)合建立免疫結(jié)合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的檢測用于抗原的檢測 小小 結(jié)結(jié) 生物素生物素親合素（鏈霉親合素）系統(tǒng)具有的多親合素（鏈霉親合素）系統(tǒng)具有的多級放大獨特效應，可極大地提高分析測定的靈級放大獨特效應，可極大地提高分析測定的靈敏度；二者之間的高親和、高特異結(jié)合以及既敏度；二者之間的高親和、高特異結(jié)合以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標記材料的特性，可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標記材料的特性，使該系統(tǒng)在標記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中的應