水稻愈傷組織的誘導實驗報告

1、水稻愈傷組織的誘導一、實驗目的1、掌握外植體的消毒方法和接種技術(shù)；2、了解愈傷組織誘導的過程。二、實驗原理以植物器官、組織、細胞等作外植體進行離體培養(yǎng)時，在一定的誘導培養(yǎng)條件下都能誘導形成愈傷組織。愈傷再經(jīng)分化培養(yǎng)，通過器官發(fā)生途徑或體細胞胚胎發(fā)生途徑可再生成植株。外植體源自自然環(huán)境均為帶菌狀態(tài)，在接種前都必須進行消毒。對于難消毒的材料，有時要幾種消毒劑配合使用；對于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著劑（吐溫20）以增強消毒效果。三、實驗材料與用具1、材料：水稻成熟種子（用于誘導愈傷組織）；2、試劑： 75%酒精， 2% NaCLO，無菌水 (每組 1 瓶 400mL) ；3、培養(yǎng)基：誘導培養(yǎng)

2、基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 8g/L （pH5.8）；4、儀器設(shè)備：培養(yǎng)室、超凈工作臺、培養(yǎng)皿（9cm） 2 個、槍形鑷、量筒（ 100mL） 2個、三角瓶（ 50mL 、無菌） 2 個、廢液缸、保鮮膜、標簽紙。四、實驗步驟1、接種室、培養(yǎng)基及用具表面消毒用 75%酒精棉球試擦超凈工作臺、鑷子，將培養(yǎng)基及用具放工作臺，打開紫外燈，照射20 分鐘以表面消毒。之后關(guān)紫外燈，打開工作臺風機，通風30 分鐘后可進行無菌操作。2、種子去殼選取飽滿、無霉變、成熟的水稻種子，手工脫去谷殼（注意保持胚完整），每人準備30粒去殼種子，并按照分組放到三角瓶中。3、操作者雙手的清洗與消

3、毒在進入無菌室之前，各操作者先用自來水清洗干凈雙手并晾干，然后進入無菌室，坐在超凈臺前位子上后，用含75%酒精的酒精噴壺噴灑雙手對雙手進行消毒，在超凈臺風口待雙手酒精風干后進入超凈工作臺。 （注意：酒精噴壺噴灑雙手時切記不要把酒精噴到超凈臺的有機玻璃板上?。?、超凈臺面的表面消毒（以下工作在超凈工作臺內(nèi)進行）用槍形鑷子從含 75%酒精棉球的容器中取一團棉球，仔細把整個超凈臺面擦試一遍，盡量降低超凈臺面的帶菌量，并將廢棉球丟到廢液缸中，然后點亮超凈臺里面放置的酒精燈。5、外植體消毒（分組操作，每組由一位代表操作完成外植體的消毒工作）將脫谷殼米粒轉(zhuǎn)到一 50mL無菌三角瓶加適量無菌水洗一次 （以沒

4、過種子為準，下同）棄水，倒入 75%酒精適量，搖動攪拌，放置 30 秒（過程中適當輕搖動混勻）棄酒精加適量無菌水洗一次棄水倒入適量 2%NaCLO，不時搖動攪拌，共處理 30 分鐘棄 NaCLO 用無菌水洗 3 次，每次停留 1 分鐘倒去無菌水， 將種子從三角瓶轉(zhuǎn)到帶無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中吸干。6、接種與觀察將吸干的消毒種子用無菌的鑷子接入培養(yǎng)基并均勻放置，每皿接10 粒，每人共接種 2皿。接種完成后，將培養(yǎng)皿蓋上并用保鮮膜封口，然后將接種有材料的培養(yǎng)皿移出超凈臺，貼上標簽寫明日期、接種人，按照班級統(tǒng)一放入一籃子，再將籃子放入培養(yǎng)室進行25暗培養(yǎng)。注意每隔2-3 天前來觀察一次實驗現(xiàn)象，1 周

5、后調(diào)查計算污染率， 14 天后調(diào)查計算愈傷組織誘導率。污染的種子數(shù)×100%污染率 (%)= 接種的總種子數(shù)形成愈傷組織的種子數(shù)誘導率 (%)=× 100%接種的總種子數(shù)五、實驗結(jié)果本次實驗我組未出現(xiàn)被污染的種子，污染率均為0 。說明實驗過程中，我組成員操作規(guī)范，保證所接種的種子均不受到污染。最后，我組的 2 個培養(yǎng)皿分別可以誘導出7 和 8 株水稻苗，誘導率分別為70%和 80% 。六、 討論與分析1、本實驗出現(xiàn)污染的原因分析。1）外植體消毒不徹底，表面有較多微生物殘留；2）實驗用具如鑷子等消毒不徹底，在操作過程中把微生物帶到種子上，污染種子；3）實驗前，超凈工作臺沒有充分消毒，臺內(nèi)（主要是空氣中）還殘留有較多微生物；4）培養(yǎng)皿密封措施做得不好，致使培養(yǎng)期間有微生物進入到培養(yǎng)皿中，并生長繁殖。2、降低實驗中的污染率的方法。1）外植體、實驗用具、超凈工作臺均需徹底消毒；2）做好密封措施；3）操作時勿離酒精燈太遠；4）盡量縮短操作時間；5）定時更換消毒液