水稻愈傷組織的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、水稻愈傷組織的誘導(dǎo)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握外植體的消毒方法和接種技術(shù)；2、了解愈傷組織誘導(dǎo)的過(guò)程。二、實(shí)驗(yàn)原理以植物器官、組織、細(xì)胞等作外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，在一定的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下都能誘導(dǎo)形成愈傷組織。愈傷再經(jīng)分化培養(yǎng)，通過(guò)器官發(fā)生途徑或體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑可再生成植株。外植體源自自然環(huán)境均為帶菌狀態(tài)，在接種前都必須進(jìn)行消毒。對(duì)于難消毒的材料，有時(shí)要幾種消毒劑配合使用；對(duì)于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著劑（吐溫20）以增強(qiáng)消毒效果。三、實(shí)驗(yàn)材料與用具1、材料：水稻成熟種子（用于誘導(dǎo)愈傷組織）；2、試劑： 75%酒精， 2% NaCLO，無(wú)菌水 (每組 1 瓶 400mL) ；3、培養(yǎng)基：誘導(dǎo)培養(yǎng)

2、基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 8g/L （pH5.8）；4、儀器設(shè)備：培養(yǎng)室、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)皿（9cm） 2 個(gè)、槍形鑷、量筒（ 100mL） 2個(gè)、三角瓶（ 50mL 、無(wú)菌） 2 個(gè)、廢液缸、保鮮膜、標(biāo)簽紙。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、接種室、培養(yǎng)基及用具表面消毒用 75%酒精棉球試擦超凈工作臺(tái)、鑷子，將培養(yǎng)基及用具放工作臺(tái)，打開(kāi)紫外燈，照射20 分鐘以表面消毒。之后關(guān)紫外燈，打開(kāi)工作臺(tái)風(fēng)機(jī)，通風(fēng)30 分鐘后可進(jìn)行無(wú)菌操作。2、種子去殼選取飽滿(mǎn)、無(wú)霉變、成熟的水稻種子，手工脫去谷殼（注意保持胚完整），每人準(zhǔn)備30粒去殼種子，并按照分組放到三角瓶中。3、操作者雙手的清洗與消

3、毒在進(jìn)入無(wú)菌室之前，各操作者先用自來(lái)水清洗干凈雙手并晾干，然后進(jìn)入無(wú)菌室，坐在超凈臺(tái)前位子上后，用含75%酒精的酒精噴壺噴灑雙手對(duì)雙手進(jìn)行消毒，在超凈臺(tái)風(fēng)口待雙手酒精風(fēng)干后進(jìn)入超凈工作臺(tái)。 （注意：酒精噴壺噴灑雙手時(shí)切記不要把酒精噴到超凈臺(tái)的有機(jī)玻璃板上！）4、超凈臺(tái)面的表面消毒（以下工作在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行）用槍形鑷子從含 75%酒精棉球的容器中取一團(tuán)棉球，仔細(xì)把整個(gè)超凈臺(tái)面擦試一遍，盡量降低超凈臺(tái)面的帶菌量，并將廢棉球丟到廢液缸中，然后點(diǎn)亮超凈臺(tái)里面放置的酒精燈。5、外植體消毒（分組操作，每組由一位代表操作完成外植體的消毒工作）將脫谷殼米粒轉(zhuǎn)到一 50mL無(wú)菌三角瓶加適量無(wú)菌水洗一次 （以沒(méi)

4、過(guò)種子為準(zhǔn)，下同）棄水，倒入 75%酒精適量，搖動(dòng)攪拌，放置 30 秒（過(guò)程中適當(dāng)輕搖動(dòng)混勻）棄酒精加適量無(wú)菌水洗一次棄水倒入適量 2%NaCLO，不時(shí)搖動(dòng)攪拌，共處理 30 分鐘棄 NaCLO 用無(wú)菌水洗 3 次，每次停留 1 分鐘倒去無(wú)菌水， 將種子從三角瓶轉(zhuǎn)到帶無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中吸干。6、接種與觀(guān)察將吸干的消毒種子用無(wú)菌的鑷子接入培養(yǎng)基并均勻放置，每皿接10 粒，每人共接種 2皿。接種完成后，將培養(yǎng)皿蓋上并用保鮮膜封口，然后將接種有材料的培養(yǎng)皿移出超凈臺(tái)，貼上標(biāo)簽寫(xiě)明日期、接種人，按照班級(jí)統(tǒng)一放入一籃子，再將籃子放入培養(yǎng)室進(jìn)行25暗培養(yǎng)。注意每隔2-3 天前來(lái)觀(guān)察一次實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，1 周

5、后調(diào)查計(jì)算污染率， 14 天后調(diào)查計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。污染的種子數(shù)×100%污染率 (%)= 接種的總種子數(shù)形成愈傷組織的種子數(shù)誘導(dǎo)率 (%)=× 100%接種的總種子數(shù)五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果本次實(shí)驗(yàn)我組未出現(xiàn)被污染的種子，污染率均為0 。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我組成員操作規(guī)范，保證所接種的種子均不受到污染。最后，我組的 2 個(gè)培養(yǎng)皿分別可以誘導(dǎo)出7 和 8 株水稻苗，誘導(dǎo)率分別為70%和 80% 。六、 討論與分析1、本實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)污染的原因分析。1）外植體消毒不徹底，表面有較多微生物殘留；2）實(shí)驗(yàn)用具如鑷子等消毒不徹底，在操作過(guò)程中把微生物帶到種子上，污染種子；3）實(shí)驗(yàn)前，超凈工作臺(tái)沒(méi)有充分消毒，臺(tái)內(nèi)（主要是空氣中）還殘留有較多微生物；4）培養(yǎng)皿密封措施做得不好，致使培養(yǎng)期間有微生物進(jìn)入到培養(yǎng)皿中，并生長(zhǎng)繁殖。2、降低實(shí)驗(yàn)中的污染率的方法。1）外植體、實(shí)驗(yàn)用具、超凈工作臺(tái)均需徹底消毒；2）做好密封措施；3）操作時(shí)勿離酒精燈太遠(yuǎn)；4）盡量縮短操作時(shí)間；5）定時(shí)更換消毒液