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1、生化實(shí)驗(yàn) 過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定 傅璐121140012 2013/11/28過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定傅璐121140012一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解米氏常數(shù)的測(cè)定方法2. 學(xué)習(xí)提取生物組織中的酶二、 實(shí)驗(yàn)原理1. 米氏反應(yīng)動(dòng)力學(xué)米氏方程(Michaelis-Menten Equation):2. 米氏常數(shù)的意義: 反映酶的種類(lèi):Km是一種酶的特征常數(shù),只與酶的種類(lèi)有關(guān),與酶濃度、底物濃度無(wú)關(guān)。 米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度Vmax一半時(shí)的底物濃度。其數(shù)值大小反映了酶與底物之間的親和力:Km值越大,親和力越弱,反之Km值越小,親和能力越強(qiáng)。 Km可用來(lái)判斷酶(多功能酶)的最適底物:Km值
2、最小的酶促反應(yīng)對(duì)應(yīng)底物就是該酶的最適底物。3.米氏常數(shù)的求法:生化實(shí)驗(yàn) 過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定 傅璐1211400122013/11/28該作圖法應(yīng)用最廣。但在低濃度是v值誤差較大,在S等差值實(shí)驗(yàn)時(shí)作圖點(diǎn)較集中于縱軸。因此在設(shè)計(jì)底物濃度時(shí),最好將1/S配成等差數(shù)列,這樣可使點(diǎn)距較為平均,再配以最小二乘回歸法,就可以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。此法優(yōu)點(diǎn)是橫軸上點(diǎn)分布均勻,缺點(diǎn)是1/v會(huì)放大誤差,同時(shí)對(duì)底物濃度的選擇有要求。SKm時(shí)直線(xiàn)將在原點(diǎn)附近與軸相交。4.氧化酶:生物體內(nèi)重要的三種氧化酶類(lèi),其作用均是消除體內(nèi)自由基: POD:過(guò)氧化物酶SOD:超氧化物歧化酶CAT:;過(guò)氧化氫酶5.過(guò)氧化氫酶的作用
3、:植物體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使過(guò)氧化氫發(fā)生積累。過(guò)氧化氫可進(jìn)行一步生成氫氧自由基。氫氧自由基是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧,可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子,并且有非常高的速度常數(shù),破壞性極強(qiáng),可使細(xì)胞膜遭受損害,加速細(xì)胞的衰老和解體。過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)可以清除過(guò)氧化氫、分解氫氧自由基,保護(hù)機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常生活,因此CAT是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一,其活性高低與植物的抗逆性密切相關(guān)。6.過(guò)氧化氫酶活力的測(cè)定方法:生化實(shí)驗(yàn) 過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定 傅璐121140012 2013/11/28紫外吸收法:過(guò)氧化氫在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收,過(guò)
4、氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫,使反應(yīng)溶液吸光度(A240nm)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光度的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活性。(以一分鐘內(nèi)A240nm下降0.1為一個(gè)單位)滴定法(高錳酸鉀法、碘量法)在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量(反應(yīng)過(guò)量)的過(guò)氧化氫溶液,經(jīng)酶促反應(yīng)后,用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液(在酸性條件下)滴定多余的過(guò)氧化氫。根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)消耗的過(guò)氧化氫的量即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶活力大小。7.實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng) :H2O2被過(guò)氧化氫酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性環(huán)境中滴定, 根據(jù)反應(yīng)前后的濃度差可以算出反應(yīng)速度:酶2H2O2 2H2O + O22KMnO4+5H2O2+3
5、H2SO4 2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2(本實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯提供過(guò)氧化氫酶)三、 實(shí)驗(yàn)試劑1. 0.02mol/L 磷酸緩沖溶液 (pH=7.0): 實(shí)驗(yàn)室提供.2. 酶液: 稱(chēng)取馬鈴薯 5g, 加緩沖液 10mL, 勻漿過(guò)濾.3. 0.01mol/L 高錳酸鉀.4. 0.098mol/L H2O2.5. 25%H2SO4.四、 實(shí)驗(yàn)操作取 6 只錐形瓶, 按下表的順序加入試劑.先加好過(guò)氧化氫和蒸餾水, 加酶液后立即混合, 依次記錄各瓶的起始反應(yīng)時(shí)間. 反映到達(dá) 5min 立即加入2ml 25%硫酸終止反應(yīng), 充分混勻.。用 0.01mol/L 的 KMnO4溶液滴定瓶中剩余的過(guò)氧化氫
6、至微紅色, 記錄消耗的高錳酸鉀體積.。生化實(shí)驗(yàn) 過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定 傅璐121140012 2013/11/28五、注意事項(xiàng):1.反應(yīng)時(shí)間必須準(zhǔn)確。2.酶濃度須均一,若酶活力過(guò)大,應(yīng)適當(dāng)稀釋。3.滴定終點(diǎn)的判定。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:過(guò)氧化氫濃度:0.098mol/L稱(chēng)取馬鈴薯的質(zhì)量:5.00g生化實(shí)驗(yàn) 過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定 傅璐121140012 2013/11/28米氏常數(shù)Km= -0.1913七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析:1.曲線(xiàn)上少一個(gè)點(diǎn)的原因:用移液管移取序號(hào)為2的過(guò)氧化氫溶液(應(yīng)為1.25ml)錯(cuò)誤的移取了1.75ml,故在制圖時(shí)將其舍去。2.曲線(xiàn)線(xiàn)性較好(R=0.9988)的原因:本實(shí)驗(yàn)采取了兩人分工的方法完成實(shí)驗(yàn),控制反應(yīng)結(jié)束及滴定分別由一人完成,所以標(biāo)準(zhǔn)都相同,從而在一定程度上提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。3. Km計(jì)算結(jié)果呈負(fù)值的原因:Km呈負(fù)值(即整條直線(xiàn)都向下移動(dòng)),亦即所有測(cè)定
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