基于礦石納米材料的DNA轉(zhuǎn)化的機(jī)理初探及方法改進(jìn)

1、生 物 工 程 學(xué) 報(bào) Chin J Biotech 2010, October 25; 26(10: 1379 1384 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb ©2010 CJB , All rights reserved. Received : May 20, 2010; Accepted : July 12, 2010Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program (No. 2007CB707802.Corresponding

2、 author: Zongbao (Kent Zhao. Tel/Fax: +86-411-84379211; E-mail: zhaozb 國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃 (No. 2007CB707802 資助。基于礦石納米材料的 DNA 轉(zhuǎn)化的機(jī)理初探及方法改進(jìn)譚海東,王磊,林金濤,趙宗保中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部,大連 116023摘 要 : 一種價(jià)格便宜、資源豐富和對(duì)人體無害的礦石納米材料 海泡石,用于微生物 DNA 轉(zhuǎn)化。該法簡(jiǎn)便、快速、 對(duì)人體健康無害,但對(duì)這種轉(zhuǎn)化方法機(jī)制的理解還有很多問題。通過小片段 RNA 競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)了與先前報(bào)道不同的 轉(zhuǎn)化機(jī)制。同時(shí)

3、,對(duì)該法進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果可以實(shí)現(xiàn)對(duì)冷藏 1個(gè)月的大腸桿菌 Escherichia coli DH5單菌落直接轉(zhuǎn)化, 無需感受態(tài)制備和處理后的溫育過程,可得到比鈣轉(zhuǎn)高的轉(zhuǎn)化率。由于可優(yōu)化的參數(shù)很多,所以這種轉(zhuǎn)化方法可以提 升的空間很大。同時(shí),該方法可用于探索其他用鈣轉(zhuǎn)和電轉(zhuǎn)未成功的微生物。 關(guān)鍵詞 : 礦石納米纖維材料,海泡石, DNA 轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化機(jī)制Mechanism of DNA transformation based on mineral nanofibers and method improvementHaidong Tan, Lei Wang, Jintao Lin, and Zon

4、gbao (Kent ZhaoBiotechnology Division, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, ChinaAbstract: Sepiolite an inexpensive, resourceful, fibrous yet inoffensive mineral made DNA transformation rapid, simple andefficient but the mechanism for DNA transformation w

5、as still unclear. Through RNA competition test, we proposed the different transforming mechanisms from the previous report. Meanwhile, we optimized the transforming method and could transfer a colony stored at 4°C for a month with plasmid through sepiolite fibers. The cells could be transformed

6、 well without competent cells preparation or incubation process. In sum, this was a novel potential transforming method, which could be explored further if the chemical method and electroporation could not be used.Keywords: mineral nanofibers, sepiolite, DNA transformation, mechanism for transformin

7、g微生物的 DNA 轉(zhuǎn)化方法是基因工程中的重要內(nèi) 容,目前對(duì)微生物轉(zhuǎn)化主要有化學(xué)法和電轉(zhuǎn)化法 1。 但這些轉(zhuǎn)化方法,仍然存在許多缺點(diǎn),比如感受態(tài)細(xì) 胞準(zhǔn)備時(shí)間長(zhǎng),處理過程容易導(dǎo)致細(xì)胞活性降低,處 理后要有溫育等過程。 2001年, Yoshida 等發(fā)表了一 系列關(guān)于使用溫石棉 (Chrysotile asbestos 實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒對(duì)原核生物轉(zhuǎn)化的有趣方法 2-5,這種方法被命名為 Yoshida 效應(yīng)。 但是這種方法仍然有很多缺點(diǎn):操作繁 瑣、利用的介質(zhì)對(duì)人體致癌等。對(duì)該法的可靠性有很 多質(zhì)疑, 限制了它的應(yīng)用 6, 所以這種新穎的 DNA 轉(zhuǎn) 化法很少被其他科學(xué)家引用。最近,這種方法又進(jìn)一步被

8、 Wilharm 等改進(jìn) 6。1380 ISSN1000-3061 CN11-1998/QChin J Biotech October 25, 2010 Vol.26 No.10J他們使用的一種價(jià)格便宜、資源豐富、對(duì)人類健康 友好的礦石納米材料海泡石 (Sepiolite 作為介質(zhì), 實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種微生物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。作者在本方法中 使用的參數(shù)與 Yoshida 等報(bào)道的一致,并根據(jù)后者 的報(bào)道, 提出了借助海泡石進(jìn)行 DNA 轉(zhuǎn)化的相同機(jī) 制。問題是海泡石和溫石棉屬于不同的介質(zhì):前者 沒有生物活性,后者有一定的生物活性;前者對(duì)人 體友好,而后者可以致癌等。因此,我們認(rèn)為這種 新的轉(zhuǎn)化方法,可能會(huì)

9、存在不同的 DNA 轉(zhuǎn)化機(jī)制。 Wilharm 等雖然對(duì)方法進(jìn)行了改進(jìn),但該工作是以 非常短的通訊形式報(bào)道,很多參數(shù)未優(yōu)化。我們認(rèn) 為對(duì)這種轉(zhuǎn)化機(jī)制的充分理解和對(duì)該試驗(yàn)參數(shù)的優(yōu) 化,會(huì)促進(jìn)這種方法的推廣和實(shí)現(xiàn)對(duì)特殊物種的 DNA 轉(zhuǎn)化。為此,我們進(jìn)行了本研究。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 質(zhì)粒和菌種pET15b 質(zhì)粒有本組保存。 E. coli DH5菌株購(gòu) 自 北 京 鼎 國(guó) 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司 。 短 乳 酸 桿 菌 Lactobacillus brevis AS 1.579購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生 物研究所菌種保藏中心。 1.1.2 試劑蛋白酶 K 、 250 bp DNA

10、 marker購(gòu)自 TaKaRa 公 司大連分公司。 200300 bp的 RNA 從短乳酸桿菌 AS 1.579提取, 在本組保存。 海泡石購(gòu)自德國(guó) Kremer Pigmente 有限公司 (Kremer Pigmente GmbH & Co. KG , Hauptstr. 41 47DE 88317 Aichstetten, Germany , 產(chǎn)品編號(hào) 58945。溶菌酶、鹽酸胍、十六烷基三甲 基溴化胺 (CTAB、苯酚和瓊脂糖購(gòu)自北京鼎國(guó)生 物技術(shù)有限公司。其他培養(yǎng)基及生化試劑牛肉膏、 胰蛋白胨、酵母粉、氯仿和異戊醇等均為分析醇, 購(gòu)自大連博諾生物化學(xué)試劑廠。1.2 方法1.

11、2.1 海泡石懸浮液和培養(yǎng)基的準(zhǔn)備海泡石懸浮液根據(jù)文獻(xiàn)準(zhǔn)備 4%儲(chǔ)存液 6:海泡 石 121 滅菌 20 min;用去離子水配含 200 mmol/L KCl , 5 mmol/L HEPES緩沖液,用 NaOH 調(diào) pH 到 7.4, 過膜除菌。 最后配成 5% (W /V 海泡石儲(chǔ)存液。另外配 10×海泡石緩沖液 (2 mol/L KCl , 50 mmol/L HEPES , 7.4 備用。LB 培養(yǎng)基:在 950 mL去離子水中加入胰蛋白 胨 10 g,酵母提取物 5 g, NaCl 10 g,搖動(dòng)容器直 至溶解,用 NaOH 調(diào) pH 至 7.0,用去離子水定容 至 1 L

12、。取 200 mL,加入 3 g瓊脂粉。在 120 滅 菌 20 min。待溫度降到 50 左右,加入終濃度為 100 g/mL的氨芐青霉素,準(zhǔn)備 40個(gè)抗性平板。MRS 培養(yǎng)基 的 配制 :1 L蒸餾水中溶解下列組 分:胰蛋白胨 10 g,牛肉膏 10 g,酵母提取物 5 g, 葡萄糖 20 g,磷酸氫二鉀 2 g,檸檬酸三銨 2 g,乙 酸鈉 5 g,吐溫 80 1 mL,硫酸鎂 200 mg,硫酸錳 50 mg, 用高壓鍋在 121 滅菌 15 min, 調(diào) pH 到 6.8。 其中葡萄糖單獨(dú)滅菌。1.2.2 海泡石吸附 pET15b 試驗(yàn)及轉(zhuǎn)化 E. coli DH5的試驗(yàn)從于 37

13、培養(yǎng) 20 h的新鮮平板中挑取一個(gè) E. coli DH5單菌落,接種于 10 mL LB液體培養(yǎng)基 中, 37 下振蕩培養(yǎng)過夜。將該菌懸液以 1 100的 比例接種于 100 mL LB液體培養(yǎng)基中, 37 振蕩培 養(yǎng) 3 h至 OD 600=0.5左右。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中 , 冰上放置 10 min, 然后于 4 下 4 000 r/min離心 10 min。棄去上清,用預(yù)冷的海泡石緩沖液 10 mL輕輕懸浮細(xì)胞, 4 下 4 000 r/min離心 10 min。最 后用 2 mL的海泡石緩沖液懸浮,置于冰上備用。取 40 L pET15b溶液 (100 ng/L ,加入 10 L 的

14、 5% (W/V 海泡石儲(chǔ)存液, 充分混合, 取 5 L 備 用。剩余的溶液 12 000 r/min離心 30 s,用 1 mL的 海泡石緩沖液連續(xù)洗滌 2次。吸附結(jié)果用 1%的瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取備用的細(xì)胞 50 L ,加入 5 L 質(zhì)粒飽和的海 泡石 (海泡石終濃度為 0.1% , 充分混合。 取備用的 細(xì)胞 50 L ,加入 1 L 洗滌后的海泡石 (海泡石終 濃度為 0.1% ,充分混合。將 2種懸浮液加到 2個(gè) LB 氨芐青霉素抗性平板 (100 g/mL。立即用玻璃 板均勻涂抹 30 s,最后放在 37 培養(yǎng)過夜。 1.2.3 利用海泡石對(duì) pET15b 轉(zhuǎn)化 E. coli

15、 DH5的試驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化譚海東等 : 基于礦石納米材料的 DNA 轉(zhuǎn)化的機(jī)理初探及方法改進(jìn)1381J海泡石緩沖液對(duì) DNA 轉(zhuǎn)化率的影響:取備用 的細(xì)胞 50 L 2份, 1份用 LB 洗滌細(xì)胞,另外 1份 仍然保留海泡石緩沖液。分別加入 10 ng pET15b和 1 L 5% (W /V 海泡石儲(chǔ)存液, 充分混合。 將 2種懸 浮液加到 2個(gè) LB 氨芐青霉素抗性平板 (100 g/mL, 立即用玻璃板均勻涂平板 30 s,最后放在 37 培養(yǎng) 過夜。細(xì)胞濃度對(duì) DNA 轉(zhuǎn)化率的影響:分別取備用 的細(xì)胞 500 L 、 50 L 和 5 L ,前者通過離心后用 50 L 海泡石緩沖液懸浮,

16、后者加入 45 L 海泡石緩 沖液懸浮,這樣 3個(gè)樣品的 OD 600分別是 200、 20和 2。分別加入 10 ng pET15b和 1 L 5% (W /V 海 泡石儲(chǔ)存液,充分混合。將 3種懸浮液加到 2個(gè) LB 氨芐青霉素抗性平板 (100 g/mL, 立即用玻璃板均 勻涂平板 30 s,最后放在 37 培養(yǎng)過夜。海泡石的濃度對(duì) DNA 轉(zhuǎn)化率的影響:分別取備 用的細(xì)胞 50 L 3份, 分別配成海泡石終濃度為 1%, 0.1%和 0.01%的混合液。 分別加入 10 ng pET15b充 分混合。將 3種懸浮液加到 3個(gè) LB 氨芐青霉素抗 性平板 (100 g/mL, 立即用玻璃

17、板均勻涂平板 30 s, 最后放在 37 培養(yǎng)過夜。涂板次數(shù)和預(yù)干處理對(duì) DNA 轉(zhuǎn)化率的影響:取 備用的細(xì)胞 50 L 7份,分別加入 10 ng pET15b和 1 L 5% (W/V 海泡石儲(chǔ)存液, 充分混合。 將 4份懸 浮液加到 4個(gè) LB 氨芐青霉素抗性平板 (100 g/mL。 立即用玻璃板分別均勻涂抹 10次、 20次、 40次和 100次,最后放在 37 培養(yǎng)過夜。另外 3份細(xì)胞, 1份立即用玻璃板均勻涂平板 30 s,第 2份 10 min后 用玻璃板均勻涂平板 30 s,第 3份 20 min后用玻璃 板均勻涂平板 30 s,最后放在 37 培養(yǎng)過夜。 1.2.4 利用海

18、泡石對(duì) pET15b 直接轉(zhuǎn)化 E. coli DH5單菌落取 4 存放 1個(gè)月的 E. coli DH5單菌落, 加入 20 L 海泡石緩沖液,加入 100 ng pET15b和 1 L 5% (W/V 海泡石儲(chǔ)存液,充分混合。將細(xì)胞懸浮 液加到 LB 氨芐青霉素抗性平板 (100 g/mL。 立即 用玻璃板均勻涂平板 30 s, 最后放在 37 培養(yǎng)過夜。 1.2.5 短乳酸桿菌 AS1.579小片段 RNA 的提取為了獲得短乳酸桿菌 AS1.579小片段 RNA ,該提取使用不加 RNAase 的基因組提取方法,參考分 子克隆實(shí)驗(yàn)指南 7,并對(duì)此方法進(jìn)行優(yōu)化。簡(jiǎn)述如 下:取單克隆短乳酸桿

19、菌到 10 mL MRS培養(yǎng)基中, 200 r/min、 37 培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按 1 50接 入 100 mL MRS中 , 200 r/min、 37 培 養(yǎng) 至 OD 600=0.5。 10 000 r/min離心 30 s,收集沉淀,使用 500 mmol/L的 EDTA 洗滌 3次,最后用 2 mL的 500 mmol/L EDTA懸浮, 200 W微波處理 1 min8-9。 10 000 r/min離心 30 s收集沉淀,取 50 mg菌體用 400 L TE重懸于 1.5 mL離心管中,加入終濃度為 10 mg/mL溶菌酶, 10 mmol/L的 DTT , 37 保溫

20、1 h。 加入 50 L 蛋白酶K (10 mg/mL, 混勻, 65 , 1 h。 加入 100 L 5 mol/L NaCl混勻,再加入 80 L 的 CTAB/NaCl混勻, 65 10 min 。加入固體的鹽酸胍 至終濃度 6 mol/L10,待細(xì)胞徹底裂解后,加入等 體積酚 /氯仿 /異戊醇混合液 (25 24 1 ,混勻, 12 000 r/min離心 5 min,取上清,加 0.6倍體積的 異丙醇,混勻,室溫放置 10 min。 12 000 r/min離心 10 min。沉淀用 75%的乙醇洗滌,晾干,最后用 20 L TE溶解,取 3 L 電泳檢測(cè)。1.2.6 小片段 RNA

21、 對(duì) pET15b 轉(zhuǎn)化 E. coli DH5的影響取 1 L 5% (W/V 海泡石儲(chǔ)存液,加入 5 L 小片段的 RNA 提取液 (200 ng/L ,充分混合,讓 海泡石飽和吸附 RNA 。 加入 10 ng pET15b和備用的 細(xì)胞 50 L ,充分混合。將細(xì)胞懸浮液加到 LB 氨芐 青霉素抗性平板 (100 g/mL。 立即用玻璃板均勻涂 平板 30 s,最后放在 37 培養(yǎng)過夜。并與不加小片 段 RNA 的作對(duì)照。2 結(jié)果2.1 海泡石吸附 pET15b 試驗(yàn)從圖 1可以看出,用 pET15b 飽和后的海泡石, 經(jīng)過海泡石緩沖液充分洗滌后的海泡石幾乎檢測(cè)不 到 DNA 。此結(jié)果

22、說明海泡石對(duì)質(zhì)粒的 pET15b 吸附 能力很弱,幾乎看不到 DNA 吸附。用 pET15b 飽和 的海泡石轉(zhuǎn)化細(xì)胞,長(zhǎng)出的克隆數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于洗滌后 的海泡石轉(zhuǎn)化數(shù) (圖 2, 16-17 。這些結(jié)果說明,利 用海泡石實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,有可能不是海泡石將 DNA1382 ISSN1000-3061 CN11-1998/QChin J Biotech October 25, 2010 Vol.26 No.10 J帶入宿主內(nèi)的,而是由海泡石在宿主表面產(chǎn)生的瞬 間小孔,導(dǎo)致 DNA 的隨機(jī)進(jìn)入。圖 1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)海泡石吸附 pET15b 能力Fig. 1 Analysis of 1% agaro

23、se electrophoresis for the ability of sepiolite absorbing pET15b. 1: pET15b; 2: the sepiolite absorbing pET15b saturatedly; 3: the sepiolite saturated with DNA was washed once; 4: the sepiolite saturated with DNA was washed two times.圖 2 海泡石用于 E. coli DH5DNA 轉(zhuǎn)化的參數(shù)優(yōu)化Fig. 2 Optimization of DNA transfo

24、rmation for E. coli DH5 based on sepiolite. 1 2: the effect of sepiolite buffer for transformation. 3 5: the cell concentration is OD 600=200, 20 and 2 in sample 3, 4 and 5 respectively. 6 8: the percent content of sepiolite is 1%, 0.1% and 0.01% in sample 6, 7 and 8 respectively; 9 12: the circulat

25、ing times are 10, 20, 40 and 100 in sample 9, 10, 11 and 12 respectively. 13 15: the pre-dry treatment is 0 min, 10 min and 20 min in sample 13, 14 and 15 respectively; 16 17: washing effect for transformation; 18 19: the effect of RNA treatment for transformation.2.2 利用海泡石對(duì) pET15b 轉(zhuǎn)化 E. coli DH5的 試

26、驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化2.2.1 緩沖液試驗(yàn)結(jié)果表明,使用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化率略高于使用 海泡石緩沖液 (圖 2, 12。另外海泡石緩沖液配制 和過膜除菌的操作繁瑣,利用培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,將 使轉(zhuǎn)化變得更加直接。 2.2.2 細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度是決定轉(zhuǎn)化率高低的重要參數(shù),我們研究表明當(dāng)細(xì)胞濃度在 OD 600=20時(shí)轉(zhuǎn)化率最高 (圖 2, 35。不同于電轉(zhuǎn),細(xì)胞濃度越高轉(zhuǎn)化率越高。 這可能與海泡石物理運(yùn)動(dòng)空間需要有關(guān),細(xì)胞濃度 太高,海泡石纖維不能充分運(yùn)動(dòng),限制了質(zhì)粒對(duì)細(xì) 胞的有效轉(zhuǎn)化。 2.2.3 海泡石濃度試驗(yàn)結(jié)果表明使用海泡石的濃度比報(bào)道的高了 近 10倍,而轉(zhuǎn)化率有 5倍以上增加 (圖 2, 68。 我們認(rèn)為

27、使用 0.1%的海泡石濃度,而不是 0.01%, 轉(zhuǎn)化率會(huì)更高些。具體原因不很清楚,是否由于不 同批次產(chǎn)品之間存在納米纖維材料數(shù)量的差異。 2.2.4 涂平板次數(shù)和狀態(tài)菌液不經(jīng)預(yù)干處理,直接涂抹平板,隨著涂抹 次數(shù)的增加,轉(zhuǎn)化率逐漸增加 (圖 2, 912。另外, 隨著預(yù)干處理時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化率會(huì)逐漸降低 (圖 2, 1315。2.3 利用海泡石對(duì) pET15b 直接轉(zhuǎn)化 E. coli DH5單菌落在 4 儲(chǔ)存 1個(gè)月的單菌落,利用海泡石仍然可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。取 4 儲(chǔ)存 1個(gè)月的單 菌落,利用海泡石直接轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率低于 100/g pET15b 。但是,該操作大大節(jié)省了時(shí)間,不需要轉(zhuǎn) 化

28、前的再培養(yǎng),沒有感受態(tài)制備或超低溫凍存和轉(zhuǎn) 化后的溫育等過程。同時(shí)單菌落的直接轉(zhuǎn)化,由于 菌量過少,通過鈣轉(zhuǎn)和電轉(zhuǎn)難以實(shí)現(xiàn)。當(dāng)然,本操 作不適用于對(duì)轉(zhuǎn)化率要求非常高的實(shí)驗(yàn),但可以在 條件非常落后的實(shí)驗(yàn)室中普及。該操作也可用于某 些特殊的實(shí)驗(yàn),比如某些致病菌對(duì)抗性質(zhì)粒的易感 染性等。譚海東等 : 基于礦石納米材料的 DNA 轉(zhuǎn)化的機(jī)理初探及方法改進(jìn)1383 J2.4 短乳酸桿菌 AS1.579小片段 RNA 的提取為了得到理想化的 RNA 小片段, 采取基因組提 取方法得到降解的 RNA 片段。 經(jīng)過該試驗(yàn), 可以從 短乳酸桿菌得到理想的小片段 RNA :濃度較高,大 于 200 ng/L ;

29、分子量在 300 bp左右 (圖 3 , 根據(jù)文 獻(xiàn)報(bào)道,非常適合用于海泡石上 DNA 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試 驗(yàn)。同時(shí),我們也嘗試了其他微生物的 RNA 提取, 但是得到的 RNA 總是一條模糊的帶,分子量集中 在 500 bp和 2 kb之間, 不符合本試驗(yàn)的需要。 對(duì)這 種結(jié)果的差異,無法從試驗(yàn)過程中得知。圖 3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)短乳酸桿菌 AS1.579小片 段 RNA 的提取Fig. 3 Analysis of 1% agarose for small RNA extraction from Lactobacillus brevis AS1.579. M: marker; 1: small

30、 RNA.2.5 小片段 RNA 對(duì) pET15b 轉(zhuǎn)化 E. coli DH5的影響經(jīng)小片段 RNA 飽和的海泡石轉(zhuǎn)化 E. coli DH5, 與對(duì)照組相比,幾乎沒有什么變化 (圖 2, 1819。同 樣說明,利用海泡石實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,有可能不是海泡 石帶 DNA 進(jìn)入宿主內(nèi),而是由海泡石在宿主表面產(chǎn) 生的瞬間小孔,導(dǎo)致外源 DNA 的隨機(jī)進(jìn)入。3 討論利用海泡石轉(zhuǎn)化有以下優(yōu)點(diǎn):可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒對(duì) 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化;這種介質(zhì)對(duì)人體健康友好,無致癌物 質(zhì);本身無生物活性,不會(huì)對(duì)宿主生長(zhǎng)產(chǎn)生影響; 操作過程中不需特殊的設(shè)備;不需要感受態(tài)的制備 就可以得到較高的轉(zhuǎn)化率;另外,資源豐富、價(jià)格 便宜,使這種轉(zhuǎn)化

31、方法容易推廣。但是,關(guān)于基于礦石海泡石納米材料的 DNA轉(zhuǎn)化機(jī)制仍然不很清楚。 Yoshida 等利用溫石棉進(jìn)行 DNA 試驗(yàn),提出競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制,即海泡石溫石棉大量吸 附 DNA ,借助涂平板的機(jī)械摩擦力,纖維絲插入宿 主內(nèi)。宿主內(nèi)的 RNA 與海泡石溫石棉上的 DNA 競(jìng) 爭(zhēng) , 從 而 實(shí) 現(xiàn) 外 源 基 因 對(duì) 原 核 生 物 的 轉(zhuǎn) 化 6,11。 Wilharm 等對(duì)此方法進(jìn)行了改進(jìn),采用無生物活性, 對(duì)人環(huán)境友好的海泡石進(jìn)行了 DNA 轉(zhuǎn)化。 但他們提 出的轉(zhuǎn)化機(jī)制仍然與 Yoshida 等報(bào)道的相同。而我 們?cè)囼?yàn)表明海泡石吸附 DNA 的能力不是很強(qiáng), 洗滌 后,轉(zhuǎn)化率大大降低。而用

32、 RNA 飽和后的海泡石, 轉(zhuǎn)化率幾乎沒有降低,這些結(jié)果說明,海泡石的作 用是借助一種瞬間機(jī)械力,在細(xì)胞膜上擊出孔,借 此外源 DNA 隨即進(jìn)入細(xì)胞。這種開孔現(xiàn)象是可逆 的,移開海泡石,細(xì)胞膜會(huì)自動(dòng)修復(fù),將開孔重新 封閉。 細(xì)胞的這一特性, 可使一些細(xì)胞外源 DNA 轉(zhuǎn) 入細(xì)胞內(nèi),從而達(dá)到復(fù)制或表達(dá)的目的。另外,由 于對(duì) DNA 轉(zhuǎn)化機(jī)制理解的不同, 導(dǎo)致操作方法有差 異。 Wilharm 等根據(jù)他們提出的機(jī)制認(rèn)為,在涂平 板前要經(jīng)過預(yù)干處理 6。根據(jù)我們對(duì)該機(jī)制的理解, 預(yù)干處理對(duì)提高 DNA 轉(zhuǎn)化率不利。不經(jīng)預(yù)干過程, 用玻璃棒立即涂平板,轉(zhuǎn)化率較高。而對(duì)照組,隨 著預(yù)干處理時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)

33、化率會(huì)逐漸降低 (圖 2, 樣品 1315。在重新了解這種基于礦石納米材料微生物轉(zhuǎn)化 機(jī)制基礎(chǔ)上,我們對(duì)該轉(zhuǎn)化進(jìn)行了優(yōu)化:使用對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)初期的細(xì)胞為宿主,細(xì)胞濃度 OD 600在 1020之間,海泡石的濃度為 0.1%,不經(jīng)預(yù)干過程,不需 要特定的緩沖液,持續(xù)涂平板時(shí)間在 1 min以上, 可以實(shí)現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)化率,有時(shí)高于鈣轉(zhuǎn)。這些不同 于最近的報(bào)道 6,但我們的轉(zhuǎn)化方法變得更直接, 轉(zhuǎn)化時(shí)間變得更短。由于我們使用轉(zhuǎn)化率較低的 pET15b 作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 說明這種方法可以用于多種 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。使用其他質(zhì)粒如 pUC18等可以得到大 于 1×106/g 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率。這種轉(zhuǎn)化方法適用于

34、雙 鏈環(huán)狀 DNA (質(zhì)粒 ,線型 DNA 和其他微生物的轉(zhuǎn) 化有待摸索。當(dāng)然這種轉(zhuǎn)化方法與電轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)化率還有很大差 距,不同的人操作,會(huì)有較大的差異。但該方法無 需感受態(tài)的制備、不需要貴重的儀器、甚至單菌落1384 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech October 25, 2010 Vol.26 No.10 冷藏 1 個(gè)月都可以直接實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，所以這種方法的 簡(jiǎn)便性會(huì)得到很多研究者的青睞。海泡石用于微生 物的 DNA 轉(zhuǎn)化屬于一種非常新的轉(zhuǎn)化方法，而且 提升的空間很高。在我們的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)將 DNA 與 E. coli DH5 在微型離心管內(nèi)混合，

35、槍頭的隨機(jī)抽動(dòng) 就可以實(shí)現(xiàn) DNA 的轉(zhuǎn)化， 該現(xiàn)象預(yù)示可以通過海泡 石、DNA 和微生物的共培養(yǎng)就可以實(shí)現(xiàn) DNA 的轉(zhuǎn) 化， 這為研究特種微生物的 DNA 轉(zhuǎn)化提供很新的方 法。另外，海泡石可以用于革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化 1。 但該方法用于真核生物的 DNA 轉(zhuǎn)化還沒有報(bào)道， 根 據(jù)現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化機(jī)制推理，這種方法應(yīng)該很快被用于 真核生物的轉(zhuǎn)化。 antibiotic resistance by incorporation of exogenous plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 60(4: 461468. 5 Yoshida N, Na

36、kajima-Kambe T, Matsuki K, et al. Novel plasmid transformation method mediated by chrysotile, sliding friction, and elastic body exposure. Anal Chem Insights, 2007, 2: 915. 6 Wilharm G, Lepka D, Faber F, et al. A simple and rapid method of bacterial transformation. J Microbiol Methods, 2010, 80(2: 2

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