病毒檢驗技術(shù)ppt課件

1、第十七章病毒檢驗技術(shù) 本 章 內(nèi) 容 第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送 1第二節(jié) 病毒的分離與鑒定2第三節(jié) 病毒學(xué)檢測及診斷3學(xué)習(xí)目標(biāo)及重點(diǎn) 學(xué)習(xí)目標(biāo)： 掌握病毒標(biāo)本采集和送檢應(yīng)遵循的原則；病毒檢驗鑒定常用技術(shù)熟悉病毒血清學(xué)診斷常用的方法了解病毒感染的實驗室快速診斷學(xué)會病毒的培養(yǎng)基本操作本章重點(diǎn)： 病毒標(biāo)本采集和運(yùn)送原則。病毒學(xué)診斷及鑒定常用方法。病毒培養(yǎng)的基本操作。病毒學(xué)檢驗技術(shù)是用實驗室檢驗方法對臨床和流行病學(xué)現(xiàn)場送檢的標(biāo)本（如人或宿主的血液、組織、尿、糞便和組織液等）進(jìn)行病毒學(xué)的定性和定量分析，為病毒感染和病毒性疾病的診斷、治療和預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。檢驗程序包括標(biāo)本的采集、分離培養(yǎng)鑒定、快速

2、診斷。第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送 一、標(biāo)本的采集與處理1. 采集時間：發(fā)病早期或急性期盡快采集。很多急性病毒感染，癥狀出現(xiàn)前病毒已經(jīng)開始釋放，癥狀初期病毒量即迅速達(dá)到峰值，之后平緩下降至疾病痊愈，不過也有例外。第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送 一、標(biāo)本的采集與處理2.采集部位：取決于臨床癥狀和所懷疑感染的病毒。從病原體入侵部位取材從病原體感染的靶器官取材根據(jù)病原體的排泄途徑取材從環(huán)境中采集標(biāo)本 如：流感病毒感染-鼻咽拭子 乙型腦炎病毒感染-腦脊液 輪狀病毒感染-糞便 乙型肝炎病毒感染-血液第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送 一、標(biāo)本的采集與處理3.采集方法與處理 提高病毒的分離率，防止標(biāo)本污染。

3、采集時無菌操作,可加入抗生素以殺死雜菌二、二、標(biāo)本的運(yùn)送與保存 1.1.標(biāo)本的運(yùn)送盡快送檢冷凍、冷藏運(yùn)輸防漏、專人、標(biāo)記2.2.標(biāo)本的保存-70可較長時間保存可加入甘油或二甲基亞砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防病毒失活第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送 n 不同的病毒分離時采用不同的分離方法,這主要取決于目的病毒的生物學(xué)特性。n 主要有細(xì)胞培養(yǎng)法、雞胚培養(yǎng)法、動物接種法等,而對細(xì)胞、雞胚不敏感,又沒有合適動物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。第二節(jié) 病毒的分離與鑒定一、 病毒的分離培養(yǎng) 2.雞胚培養(yǎng) 第二節(jié) 病毒的分離與鑒定原代細(xì)胞培養(yǎng)二倍體細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞 羊膜腔接種尿囊腔接種卵黃囊

4、接種絨毛尿囊膜接種組織細(xì)胞培養(yǎng) 雞胚培養(yǎng) 動物接種是將離體活組織塊或分散的組織細(xì)胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。（一）組織細(xì)胞培養(yǎng) 雞成纖維細(xì)胞Hep-2細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)瓶Vero細(xì)胞第二節(jié) 病毒的分離與鑒定1.原代細(xì)胞原代細(xì)胞是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。2.二倍體細(xì)胞是指原代細(xì)胞在體外分裂50代以后仍能保持其二倍染色體數(shù)目。二倍體細(xì)胞株來源于正常人胎兒組織，主要用于培養(yǎng)病毒制備疫苗等。3.傳代細(xì)

5、胞傳代細(xì)胞來源于腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株傳代過程中變異的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞，它們能在體外無限期地傳代。大多是腫瘤細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞。常用的傳代細(xì)胞株有Hela細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞），Hep-2（人喉上皮癌細(xì)胞）、Vero（非洲綠猴腎細(xì)胞）等。2.雞胚培養(yǎng)第二節(jié) 病毒的分離與鑒定雞胚培養(yǎng)法是用來培養(yǎng)某些對雞胚敏感的動物病毒的一種培養(yǎng)方法，此方法可用以進(jìn)行多種病毒的分離、培養(yǎng)，毒力的滴定，中和試驗以及抗原和疫苗的制備等。一般選用914d的雞胚來源充足、組織分化程度低、本身很少攜帶病毒和細(xì)菌、對接種病毒不產(chǎn)生抗體及病毒較易增殖等2.雞胚培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：第二節(jié) 病毒的分離與鑒定選擇不同的接種部位是病毒分離成功的關(guān)鍵

6、常用的主要有： 尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種2.雞胚培養(yǎng)第二節(jié) 病毒的分離與鑒定不同病毒在雞胚的不同部位的生長特性差異很大2.雞胚培養(yǎng)尿囊腔接種羊膜腔接種尿囊腔羊膜腔常用接種途徑： 尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的適應(yīng)和傳代培養(yǎng)常用于臨床流感病毒初次分離第二節(jié) 病毒的分離與鑒定卵黃囊接種絨毛尿囊膜接種卵黃囊絨毛尿囊膜人工氣室羊膜腔氣室絨毛尿囊膜尿囊腔 卵白2.2.雞胚培養(yǎng)主要用于蟲媒病毒、衣原體及立克次體的分離和繁殖。常用于牛痘病毒、天花病毒、單純皰疹病毒的分離卵卵黃黃囊囊第二節(jié) 病毒的分離與鑒定3.動物接種

7、常用的實驗動物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和雞等常用的接種途徑包括皮下、皮內(nèi)、腹腔、靜脈、角膜、鼻腔及腦內(nèi)接種等方式第二節(jié) 病毒的分離與鑒定二、病毒增殖的觀察（一）病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的鑒定指標(biāo) 1細(xì)胞形態(tài)的改變 2紅細(xì)胞吸附 3細(xì)胞培養(yǎng)液pH值改變（二）病毒數(shù)量及病毒感染性測定 1血凝試驗 2中和試驗 3空斑形成試驗 4半數(shù)感染量（ID50）和組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50） 第二節(jié) 病毒的分離與鑒定二、病毒增殖的觀察（一）病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的鑒定指標(biāo) 1細(xì)胞形態(tài)的改變 （1） 細(xì)胞病變效應(yīng)（cytophathic effect，CPE）第二節(jié) 病毒的分離與鑒定正常細(xì)胞 病變細(xì)胞是指某些病毒特

8、別是無包膜的病毒感染組織細(xì)胞后，正常生長的梭形細(xì)胞變圓、變性、壞死、溶解及從培養(yǎng)瓶壁脫落，細(xì)胞堆積形成葡萄狀第二節(jié) 病毒的分離與鑒定（2）多核巨細(xì)胞1細(xì)胞形態(tài)的改變多見于有包膜的病毒，如呼吸道合胞病毒、麻疹病毒等，由感染細(xì)胞融合而成多核巨細(xì)胞第二節(jié) 病毒的分離與鑒定（3）包涵體1細(xì)胞形態(tài)的改變 某些病毒感染宿主細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)一種光學(xué)顯微鏡下可見的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆?；蛏形囱b配的病毒亞基聚集而成，稱為包涵體。第二節(jié) 病毒的分離與鑒定2紅細(xì)胞吸附有些病毒感染細(xì)胞后,細(xì)胞膜上可鑲嵌著病毒基因編碼產(chǎn)生的糖蛋白,其中有些能吸附特定種類的紅細(xì)胞,或?qū)⒓?xì)胞培養(yǎng)單層

9、刮下后,經(jīng)過適當(dāng)處理,可以凝集特定種類的紅細(xì)胞,此類糖蛋白在細(xì)胞表面形成刺突,稱為血凝素。3細(xì)胞培養(yǎng)液pH值改變二、病毒增殖的觀察病毒感染細(xì)胞后，可使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化，導(dǎo)致培養(yǎng)液pH值改變。第二節(jié) 病毒的分離與鑒定（二）病毒數(shù)量及病毒感染性測定二、病毒增殖的觀察1血凝試驗 病毒顆粒紅細(xì)胞 某些病毒（如流感病毒）表面的血凝素（HA）能引起人或某些哺乳動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，將這類病毒感染細(xì)胞后收集的病毒液作不同稀釋，以發(fā)生血凝反應(yīng)的病毒液的最高稀釋度作為該病毒的血凝效價（即滴度），可對病毒含量進(jìn)行半定量測定。血凝現(xiàn)象第二節(jié) 病毒的分離與鑒定能使紅細(xì)胞完全凝集的病毒的最高稀釋倍數(shù)為該病毒的血凝效價

10、，此效價為1個血凝單位（HAU）第二節(jié) 病毒的分離與鑒定病毒顆粒 紅細(xì)胞病毒抗體 血凝抑制試驗 病毒液中若先加入病毒的特異性抗體，抗體與病毒表面的抗原特異性結(jié)合，從而抑制病毒與紅細(xì)胞的血凝現(xiàn)象，稱為血凝抑制試驗。第二節(jié) 病毒的分離與鑒定2中和試驗（Nt） 在體外孵育病毒與特異性抗體的混合物，使病毒與抗體相互反應(yīng)，再將混合物接種到敏感的宿主體內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后觀察CPE或紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象是否消失，即特異性抗體是否中和相應(yīng)病毒，從而測定殘存的病毒感染力的一種方法3空斑形成試驗第二節(jié) 病毒的分離與鑒定n 是一種檢查和準(zhǔn)確測定病毒滴度的方法。n 將稀釋的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化

11、的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細(xì)胞培養(yǎng)中有限擴(kuò)散。n 結(jié)果是每一個有感染性的病毒在單層細(xì)胞中可產(chǎn)生一個局限性的感染灶。用活性染料 (如中性紅) 染色，則活細(xì)胞著色，受病毒感染而破壞的細(xì)胞不著色，形成肉眼可見的空斑/蝕斑(plaque)。n 每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作空斑形成單位 (plaque forming unit, PFU)。n 病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。4半數(shù)感染量（ID50）和組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50） 測定病毒感染雞胚、動物或細(xì)胞后，引起50%死亡或病變的最小量。用來估計病毒感染的強(qiáng)弱程度，但不能準(zhǔn)確測定感染性病毒顆粒的多少第二節(jié) 病

12、毒的分離與鑒定 第三節(jié) 病毒學(xué)檢測及診斷一、形態(tài)學(xué)檢查及診斷 1. 光學(xué)顯微鏡檢查： *直接觀察到較大的病毒體（如痘病毒） *包涵體 狂犬病毒感染-嗜酸性包涵體 巨細(xì)胞病毒感染-“貓頭鷹眼”狀的嗜酸性包涵體 2. 電子顯微鏡檢查： *透射電子顯微鏡 用于觀察病毒的大小、形態(tài)與結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)等*掃描電子顯微鏡： 用于觀察病毒和細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)和附屬結(jié)構(gòu)等 一、形態(tài)學(xué)檢查及診斷掃描電子顯微鏡 第三節(jié) 病毒學(xué)檢測及診斷H1N1流感病毒電子顯微鏡圖片狂犬病病毒電子顯微鏡圖片 第三節(jié) 病毒學(xué)檢測及診斷（1）標(biāo)本制備 超濾法超速離心法接種細(xì)胞快速增殖法免疫凝集法（2）常用觀察方法 負(fù)染色法 超薄切片法 免疫電鏡法病毒顆粒具有亮度，在周圍較暗的背景上顯示亮點(diǎn)過程與病理切片過程相似免疫組織化學(xué)與電鏡技術(shù)的結(jié)合透射電子顯微鏡 第三節(jié) 病毒學(xué)檢測及診斷二、血清學(xué)檢測及診斷 原理：用已知的病毒抗原檢測患者血清中的抗體水平或 用已知的病毒抗體直接檢測標(biāo)本中的病毒抗原1.病毒抗原的檢測：用熒光素、酶或膠體金等標(biāo)記物標(biāo)記病毒抗體檢測標(biāo)本中的相應(yīng)病毒抗原。如ELISA檢測HBsAg 第三節(jié) 病毒學(xué)檢測及診斷2.病毒抗體的檢測：已知病毒抗原多數(shù)為通過基因工程技術(shù)制備的重組抗原，其次是從患者標(biāo)本中分