PCR3未知DNA擴(kuò)增

1、8.3 PCR8.3 PCR擴(kuò)增未知擴(kuò)增未知DNADNA片段片段 當(dāng)獲得一段DNA后，若要得到與其相鄰的未知DNA片段，可通過染色體步查來完成。 染色體步查是指從生物基因組或基因組文庫中的已知 序列出發(fā)，逐步獲得或探知其相鄰的未知序列或與 已知序列呈共線性關(guān)系的目的序列的核苷酸組成的 方法和過程。8.3.1 8.3.1 反向反向PCRPCR 反向反向PCRPCR（inverse PCRinverse PCR）是一種簡單的擴(kuò)增已知 序列周邊未知序列的方法，其擴(kuò)增原理見圖8-8。 首先用已知片段內(nèi)部沒有的限制性內(nèi)切酶切割模板DNA，再將酶切后的DNA片段連接成環(huán)狀分子，其中 至少有一個環(huán)狀分子含有

2、完整的已知片段。 根據(jù)已知片段兩端的序列設(shè)計(jì)引物，可將鄰近的DNA片段擴(kuò)增出來。圖圖8-8 8-8 反向反向PCRPCR原原理示理示意圖意圖8.3.2 8.3.2 利用接頭的利用接頭的PCRPCR 這類方法的第一步通常都是將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶切割，然后將序列已知的接頭片段連接到酶切片段兩端，以提供PCR需要的另一端引物。 根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物和根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)的引物，可將已知序列側(cè)翼的未知序列擴(kuò)增出來。巢式巢式PCRPCR反應(yīng)模式圖反應(yīng)模式圖 圖圖8-9 8-9 利用利用3 3末端修飾的接頭擴(kuò)增未知末端修飾的接頭擴(kuò)增未知DNADNA片段片段接頭一端為平末端，另一端為長長的5 5突出末

3、端，而且在3 3凹端帶有一個修飾氨基(-NH(-NH2 2)，修飾的末端在PCR擴(kuò)增時不能作為引物啟動DNA的合成。首先選擇合適的酶切位點(diǎn)酶切總基因組，將人工合成的接頭連接在酶切片段兩端，然后再做PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的引物是根據(jù)接頭的突出末端序列而設(shè)計(jì)的引物L(fēng)P1LP1和LP2LP2，以及根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物SP1SP1和SP2SP2。8.3.3 8.3.3 熱不對稱交錯熱不對稱交錯PCRPCR TAIL-PCRTAIL-PCR: thermal asymmetric interlaced PCR 利用不同的退火溫度選擇性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)片段 利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行PCR一般有3種產(chǎn)物生成：

4、由特異性引物和簡并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物(I I型產(chǎn)物型產(chǎn)物）；由同一特異性引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物（IIII型產(chǎn)物型產(chǎn)物）；由同一簡并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物（IIIIII型產(chǎn)物型產(chǎn)物）。 TAIL-PCR的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列 設(shè)計(jì)3個嵌套的特異性引物（special primer，簡稱sp1sp1，sp2sp2，sp3sp3，約20bp），用它們分別和1個具有 低Tm值的短的隨機(jī)簡并引物（arbitrary degenerate prime，ADAD，約14bp）相組合，以基因組為模板， 根據(jù)引物的長短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對稱的溫度 循環(huán)，通過分級反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物。 TAIL-PCR共分3次反應(yīng)。 TAIL-PCR用特殊的熱循環(huán)程序使PCR反應(yīng)有利于型產(chǎn)物的擴(kuò)增，而抑制型非特異性產(chǎn)物。 其中使用較長的高退火溫度的嵌套特異引物和較短的低退火溫度的隨機(jī)簡并引物，它們的退火溫度明顯 不同。 通過控制退火溫度可控制何種引物占優(yōu)勢，從而控制產(chǎn)物的擴(kuò)增。 首先首先進(jìn)行5輪高嚴(yán)謹(jǐn)度的擴(kuò)增，此時主要是特異性的引物起作用，單向擴(kuò)增目的單鏈DNA。 然后然后進(jìn)行一個低嚴(yán)謹(jǐn)度的PCR循環(huán)，隨機(jī)簡并引物起作用，此前線性擴(kuò)增的目的DNA產(chǎn)物可變成雙鏈。 在隨后的擴(kuò)增中高嚴(yán)謹(jǐn)度和中嚴(yán)謹(jǐn)度循環(huán)交錯進(jìn)行，使目的序列擴(kuò)增大大超過非特異產(chǎn)物，從而控制特異產(chǎn)物和非特異產(chǎn)物的生成比例（圖圖8-108-10）。 最后最