復(fù)方鱉甲軟肝方防治肺纖維化細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

1、復(fù)方鱉甲軟肝方防治肺纖維化細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究                                  作者：段斐，耿德海，許文杰，唐志遠(yuǎn)，史建紅【摘要】  目的通過觀察細(xì)胞凋亡，探討復(fù)方鱉甲軟肝方防治肺纖維化的機(jī)理和療效。方法選SD雄性大鼠180只，

2、隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，陽性藥物對照組，復(fù)方鱉甲軟肝方高、中、低劑量組，共6組，每組30只。博萊霉素常規(guī)造模的同時(shí)給藥，假手術(shù)組和模型組每天灌胃生理鹽水，其余4組灌藥進(jìn)行防治。各組分別于7，14，28 d隨機(jī)抽取10只大鼠，8只制成光鏡標(biāo)本，2只麻醉后快速開胸取肺組織，進(jìn)行電鏡標(biāo)本的制作。免疫組化載玻片用DEPC處理后備用。結(jié)果型和型肺泡上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞均有凋亡。bax在肺泡型和型上皮細(xì)胞，肺泡巨嗜細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜均表達(dá)。假手術(shù)組和高、中劑量組呈弱陽性表達(dá)，模型組強(qiáng)陽性表達(dá)。Bcl-2在核膜和線粒體表達(dá)，模型組強(qiáng)陽性表達(dá)，藥物組弱表達(dá)。結(jié)論復(fù)方鱉甲軟肝方通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bax活性，

3、抑制Bcl-2的活性，抑制型上皮細(xì)胞凋亡，減少纖維積聚和纖維化形成，對肺纖維化起到防治作用。 【關(guān)鍵詞】  復(fù)方鱉甲軟肝方；凋亡；超微結(jié)構(gòu)Abstract:ObjectiveTo study the preventive and therapeutic effect of compound prescription with turtle shell (CPTS) on rats with IPF (Idiopathic pulmonary interstitial fibrosis) caused by Bleomycin A5.Methods180 SD rats were ra

4、ndomly divided into six groups:sham operation group,model group,positive medicine group, high-dosage group, medium-dosage group and low-medium group.After they were given the medicine, ten rats in each group each time were killed respectively on the 7th,14th and 28th day. 8 of them were made for lig

5、ht microscope specimen. 2 rats were operated to open thorax and get lung tissue speedily. Immunohistochemical glass covers were dealt with DEPC for use.ResultsAT , AT and fibroblast all showed apoptosis, Bax expression in AT ,AT and alveolus macrophage cytoplasm,cytolemma expression was less positiv

6、e in sham operation group,high CPTS and medium CPTS groups and remarkably positive in model group,which showed CPTS could restrain apoptosis of AT and macrophage.Bcl-2 was expressed in chondriosome and on karyotheca. Expression in model group was less positive and remarkably positive in CPTS groups,

7、which showed CPTS could restrain formation of IPF.ConclusionCPTS has obvious treating effect through reducing fiber piling and restraining forming of fibrosis on rats with IPF caused by Bleomycin A5, CPTS can regulate the alveolar apoptosis by inhibiting the Bcl-2 expression, enhancing the Bax expre

8、ssion and inhibiting the apoptosis of AT .Key words:Compound prescription with turle shell;  Apoptotic;  Supermicro structure    特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化以肺泡上皮細(xì)胞凋亡（apoptosis）導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)完整性破壞和肺成纖維細(xì)胞增生為特征1。早期各種炎癥細(xì)胞和肺泡細(xì)胞分泌炎癥因子引起細(xì)胞損傷與細(xì)胞增殖失控，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的途徑，引起肺纖維化2。Bcl-2和Bax是一對相互拮抗的基因產(chǎn)物，兩者自可形成同二聚體，也可相互作用為異

9、二聚體。Bcl-2和Bax與凋亡調(diào)控直接相關(guān)：Bax增高促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2增高抑制細(xì)胞凋亡3。兩者的平衡狀態(tài)維持肺組織細(xì)胞的正常，保持呼吸功能的穩(wěn)定。1  器材1.1  藥物防治藥物：復(fù)方鱉甲軟肝方(內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)的復(fù)方中藥干粉，600 g/瓶，批號(hào)：20020501)，高劑量1.4 g·kg-1·d-1、中劑量0.7 g·kg-1·d-1、低劑量藥物為0.35 g·kg-1·d-1，相當(dāng)于臨床日用量（0.1 g·kg-1）的14倍，7倍，3.5倍。  &#

10、160; 陽性對照藥：醋酸強(qiáng)的松0.56 mg·100 g-1·d-1，廣東華南制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)011201。    造模藥物：注射用鹽酸博萊霉素(bleomycin，BLM-A5 )，日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)，批號(hào)X12100。1.2 動(dòng)物及分組SD大鼠180只，雄性，體重200220 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物級(jí)別：SPF/VAF，許可證編號(hào)：SCXK2002-0003。飼養(yǎng)于同級(jí)動(dòng)物房，自由飲水。購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。動(dòng)物隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組；模型組；陽性藥物對照組；復(fù)方鱉甲軟肝方（以下表格中簡稱鱉甲方組）

11、高、中、低劑量組。每組30只。各組均于7，14，28 d隨機(jī)抽取10只大鼠采血，同時(shí)取肺制成光、電鏡標(biāo)本。1.3 試劑凋亡試劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司分裝的Sigma公司試劑。SP-9002，ZLI-9017DAB，SC-7480 Mouse anti-Bax， SC-1666  Mouse  anti-PAR4 SC-7382  Mouse anti-BCL-2。1.4 儀器石蠟切片機(jī)，萊卡2016、包埋機(jī)，KD-BM。低溫冰箱MDFU5410(-60)成都泰盟科技有限公司，數(shù)碼顯微照相機(jī)Nikon Coolpi×4500。2 方法2.1

12、60; 大鼠肺纖維化模型制備用1.5%戊巴比妥鈉（0.1 ml·kg-1）腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部剪去毛、常規(guī)碘酒與酒精消毒，切開頸正中皮膚，逐層分離，暴露氣管，然后用一次性1 ml注射器向氣管內(nèi)注入0.3 ml博萊霉素生理鹽水溶液（5 ml·kg-1），然后立即將動(dòng)物直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。假手術(shù)組大鼠肺部注入等體積的生理鹽水。2.2  取材和切片制備2.2.1  各組光鏡取材常規(guī)取材。事先用APES處理切片，37 2448 h溫箱干燥備用。石蠟切片，厚度為5 m。脫蠟后組織片裱于APES處理后的載玻片上（免疫組化染色）

13、，入37溫箱干燥48 h備用。2.2.2  各組電鏡取材常規(guī)普通電鏡取材。2.3  免疫組化操作步驟（Bcl-2，Bax）將切片置于二甲苯、各脫蠟15 min100%酒精15 min，100%酒精15 min，95%酒精10  min90%酒精10 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，蒸餾水沖洗0.3%甲醇-過氧化氫室溫下孵育20 min蒸餾水洗兩次，2 min/次 ，PBS洗5 min0.1mol/L枸櫞酸緩沖液內(nèi)微波爐抗原修復(fù)（溫度98100）20 min室溫冷卻后加10%山羊血清，37濕盒內(nèi)室溫孵育30 min傾去血清，不洗，加一抗，鼠抗PA

14、RP(1100),鼠抗Bax和Bcl-2（1100），濕盒內(nèi)4過夜。取出濕盒室溫放置30 min，37放置1 h0.01 mol/L  PBS洗3次，5 min/次濕盒內(nèi)滴加生物素化二抗（抗鼠1100）0.01mol/L  PBS洗3次，5 min/次滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，濕盒內(nèi)37孵育30 min0.01 mol/L  PBS洗3次，5 min/次DAB顯色（1 ml蒸餾水中加入DAB、緩沖液及H2O2各一滴，混勻），顯微鏡下控制顯色程度水充分沖洗以中止顯色梯度酒精脫水：70%酒精30Sec，80%酒精1 min，90%酒精5 min，95%酒精10

15、 min，100%酒精、各30 min，二甲苯各透明20 min中性塑膠封固陰性對照用0.01 mol/L  PBS 代替一抗，其余步驟同上。2.4  結(jié)果判定在用DAB顯色的免疫細(xì)胞化學(xué)切片上，陽性反應(yīng)按顏色深淺分為：棕黃色為強(qiáng)陽性；黃色為陽性；淺黃色為弱陽性；與間質(zhì)顏色一致者為陰性。1         3  結(jié)果3.1  電鏡下細(xì)胞凋亡結(jié)果電鏡下可見型細(xì)胞核膜表面凹凸不平，染色體邊集，密度增強(qiáng)，固縮現(xiàn)象明顯。胞質(zhì)內(nèi)凋亡小體中可見膜包裹完整的細(xì)胞核碎片。型細(xì)胞細(xì)胞器和胞質(zhì)濃

16、縮，細(xì)胞膜破壞，核染色質(zhì)的凝集邊界不清。3.2   Bax和Bcl-2在肺組織中表達(dá)免疫組化結(jié)果3.2.1  Bcl-2在肺組織中免疫組化結(jié)果7 d時(shí)Bcl-2在假手術(shù)組肺組織中細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中均無表達(dá)，只在肺間隔型細(xì)胞的核膜部分表達(dá)；復(fù)方鱉甲軟肝方高、中、低劑量組在肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞部分細(xì)胞質(zhì)呈淺黃染色，呈現(xiàn)陽性表達(dá)，偶見肺巨噬細(xì)胞核著色（棕色）呈強(qiáng)陽性表達(dá)。假手術(shù)組在28 d時(shí)仍然呈肺間隔型細(xì)胞的核膜部分表達(dá)，其意義有待進(jìn)一步探討。模型組肺泡間隔細(xì)胞及巨嗜細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見分布均勻的棕色顆粒，明顯多于假手術(shù)組和藥物組。且絕大多數(shù)已進(jìn)入胞核，而復(fù)方組的Bcl-

17、2的陽性表達(dá)則偏重于胞質(zhì)。3.2.2  Bax在肺組織中免疫組化結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bax在肺組織中主要在肺泡型、部分型細(xì)胞和肺泡腔炎癥細(xì)胞的胞質(zhì)部位呈陽性表達(dá)，部分在肺泡隔間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。7 d時(shí)假手術(shù)組和高、中劑量藥物組在肺泡型和型細(xì)胞、肺泡炎癥細(xì)胞和部分間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)，尤其型細(xì)胞中表達(dá)較多，部分間質(zhì)細(xì)胞的胞核也有表達(dá)。在模型組、陽性藥物組、低劑量組在肺間隔肺泡型細(xì)胞有部分表達(dá)，在巨噬細(xì)胞胞漿呈陽性表達(dá)結(jié)果。14 d假手術(shù)組和高、中、低劑量組在肺泡間隔細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)弱陽性表達(dá)。陽性藥物組和模型組表達(dá)較弱。28 d假手術(shù)組和高、中、低劑量組肺泡間隔表達(dá)較好，呈陽性，但不如7

18、d表達(dá)明顯。肺泡型上皮細(xì)胞也有部分表達(dá)。4 討論    BLM通過損傷肺部基膜，使上皮與間質(zhì)細(xì)胞得以持續(xù)性接觸從而激活上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生過量膠原,形成不可逆肺纖維化。復(fù)方鱉甲軟肝方可以防止細(xì)胞脫落，特別是小劑量組效果最好。是否中藥在某些情況下藥量過大可以對機(jī)體產(chǎn)生毒副作用值得探討。    最近研究結(jié)果顯示13，肺泡上皮細(xì)胞凋亡在肺纖維化的發(fā)生與中可能起非常重要的作用。肌成纖維細(xì)胞在致炎因子的作用下，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的凋亡引發(fā)纖維化，這一點(diǎn)在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均得到證實(shí)。凋亡的上皮細(xì)胞主要在肌成纖維細(xì)胞的基本病灶周圍促使纖維灶的生成。另外

19、在增生的上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制蛋白p53和p21表達(dá)上調(diào)，這可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。眾所周知：在IPF的形成過程中由于炎癥的刺激，肺泡上皮細(xì)胞和各種炎癥細(xì)胞都分泌細(xì)胞因子，細(xì)胞因子以各種形式或促進(jìn)、或抑制調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的凋亡。各種細(xì)胞都存在凋亡的狀態(tài)，通過凋亡的形式調(diào)節(jié)肺泡的穩(wěn)定狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)中我們從電鏡照片中可以看到肺型和型細(xì)胞凋亡，以及成纖維細(xì)胞均有明顯的凋亡。說明這些細(xì)胞參與IPF的形成和防治過程。細(xì)胞中Bcl-2主要定位在核膜的胞質(zhì)面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體內(nèi)膜上，與膜的結(jié)合對于其發(fā)揮功能是極其重要的4。實(shí)驗(yàn)表明，失去膜定位能力的Bcl-2蛋白抗凋亡能力減弱了許多。從實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在假手術(shù)組，7

20、，14，28 d僅在肺組織中型細(xì)胞核膜中有表達(dá)，以7，28 d結(jié)果明顯；細(xì)胞內(nèi)線粒體則無表達(dá)，其意義有待進(jìn)一步探討。藥物高、中、低劑量組呈現(xiàn)陽性或弱表達(dá)，模型組呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)，說明復(fù)方鱉甲軟肝方對Bcl-2蛋白的調(diào)亡有抑制作用，通過抑制凋亡來減緩膠原的形成。有報(bào)道說：肝的炎癥早期，Bcl-2呈高表達(dá)，后期纖維化以后呈現(xiàn)低表達(dá)。同肺的假手術(shù)組一直僅在型細(xì)胞核膜表達(dá)相比有些不同，該種結(jié)果是否與不同臟器有關(guān)，還是有其他未知的影響因素4,5，有待進(jìn)一步考證。但正是同一種凋亡蛋白無論通過何種途徑在不同器官同時(shí)表達(dá)，證明其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)有相通性，從而支持了我們異病同治的理論。而同一種蛋白在不同器官有不同的表

21、現(xiàn)形式，又表達(dá)了各個(gè)器官之間的差異性。    報(bào)道Bax主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上表達(dá)4，但在7 d復(fù)方鱉甲軟肝方各組均呈陽性表達(dá)，高劑量組呈強(qiáng)陽性，并且在細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核上的也有部分表達(dá)，其原因還有待進(jìn)一步探討。28 d 陽性藥物組Bax卻有極少的表達(dá)；假手術(shù)組和復(fù)方鱉甲軟肝方高劑量組Bax在肺部的細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和肺間質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)陽性表達(dá)。14 d中間期相對較低，呈現(xiàn)弱陽性表達(dá)。表現(xiàn)為一種波浪型，同文獻(xiàn)報(bào)道不一致5,6，其原因有待進(jìn)一步探討。    總之，復(fù)方鱉甲軟肝方通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中Bax和Bcl-2的凋亡蛋白表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞增生，抑制細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)AT-II的凋亡，保持上皮細(xì)胞完整性，從而達(dá)到抗纖維化的作用。但兩者在肺中相互作用的關(guān)系，我們將在后期實(shí)驗(yàn)中探討?！疚墨I(xiàn)】  1Mohammed S, Razzaque, Nasimul Ahsan, et al.Role of apoptosis in FibrogenesisJ.Nephron,2002,90:365.2Han-ming，Zhuo Zhang，Qi-f