抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)卵黃免疫球蛋白(IgY

1、    黃清松，羅深秋，林元藻，曾位森【摘要】  目的 觀察雞卵黃中抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillinresistant staphylococcus aureus,MRSA)抗體的含量、純度、來源及穩(wěn)定性。方法 用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)作為抗原免疫Leghorn雞；通過改良水稀釋法提取卵黃中的IgY；雙紫外光波長測(cè)定抗體含量,SDSPAGE電泳檢測(cè)抗體純度；Western blot免疫印跡法測(cè)定該抗體來源；ELISA檢測(cè)IgY對(duì)溫度、酸堿度的穩(wěn)定性。結(jié)果 抗體含量13.3 mg/mL蛋黃液,抗體純度達(dá)9

2、6%；免疫印跡證明IgY與雞血清中的IgG具有相同的分子量和抗原性；IgY具有良好的熱穩(wěn)定性,對(duì)酸堿具有一定的耐受力。結(jié)論 改良水稀釋法能得到高產(chǎn)量、高純度的特異性IgY,而且有良好的生物學(xué)活性。 Abstract:Objective To observe the yield, purity, source, and stability of the methicillinresistant staphylococcus aureus (MRSA). Methods Taken the methicillinresistant staphylococcus aureus (MRSA) as a

3、ntigen immuned Leghorn fowl, IgY was extracted with improved water dilution method. Antibodys content was determined with double beam UV/VIS spectrophotometer, and antibody purity was detected with SDSPAGE electrophoresis. Antibodys source was determined by Western blot. IgYs constancy to temperatur

4、e and acidity or alkalinity was determined with ELISA. Results Antibody contained yolk liquid at 13.3 mg/mL; purity of antibody: 96%; immunoblotting showed that IgY and IgG in chicken serum had the same molecular weight and antigenicity, IgY had favorable heat stability and tolerance to acid and bas

5、e.Conclusion High yield of IgY that had highly purified specificity and favorable biologic activity can be prepared with improved water dilution method.Key words:methicillinresistant staphylococcus aureus (MRSA); immunoglobulin of yolk (IgY); antibody免疫球蛋白(immunoglobulin )是具有抗體活性的一種糖蛋白，主要存在于血漿中，也見于其

6、他體液、組織和一些分泌液中。人血漿內(nèi)的免疫球蛋白可分為5類，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）,其中IgG是最主要的免疫球蛋白。而母雞血液中的免疫球蛋白可傳遞到雞卵黃中，并且在雞發(fā)育過程中起保護(hù)作用，此種免疫球蛋白稱為雞卵黃免疫球蛋白(IgY) 1。IgG是存在于雞卵黃中的主要免疫球蛋白,而IgM和IgA則主要存在于血清蛋白中2。IgY屬多克隆抗體，多克隆抗體在疾病的診斷和防治方面具有許多特定優(yōu)點(diǎn)，通常一次性大量制備是相當(dāng)困難的，而多次制備又導(dǎo)致抗體的均一性差。母雞一經(jīng)免疫應(yīng)答后，可從其卵黃中不斷獲得特異性的

7、抗體。IgY純度高、特異性強(qiáng)，不會(huì)像其他哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的抗體那樣會(huì)發(fā)生交叉血清反應(yīng)或過敏反應(yīng),因而它是最安全的生物制劑，可替代免疫小鼠、豚鼠或兔等哺乳動(dòng)物所制備的抗體而大量生產(chǎn)。近年來，IgY的研究和應(yīng)用是免疫學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和十分活躍的課題。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是引起院內(nèi)感染的重要致病菌，其致病性強(qiáng)，對(duì)多種抗菌藥物耐藥，在治療上十分棘手。本文用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌作為抗原免疫母雞制備了抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌IgY3，4，并對(duì)其理化性質(zhì)和生物學(xué)活性進(jìn)行了研究，旨在為其以后的診斷和防治應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1  材料與方法1.1  材料1.1.1 

8、 動(dòng)物  Leghorn雞，25周齡，購于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：2007A025，常規(guī)飼養(yǎng)。1.1.2  試劑  TrisHCl緩沖液；硫酸銨；PBS緩沖液；SDSPAGE成套電泳試劑；考馬斯亮藍(lán)R250(購自北京索萊寶科技有限公司)；聚苯乙烯酶標(biāo)板(96孔，浙江黃巖新豐塑料制品廠出品)；兔抗雞卵黃免疫球蛋白IgG（上海生物制品所血液制品室提供）。1.1.3  菌種  耐甲氧西林金黃色葡萄球菌( MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC25923)獲自中國藥品生物制品鑒定所。1.1.4

9、  儀器  高速冷凍離心機(jī)(HC3018R型,科大創(chuàng)新股份有限公司)；電泳儀(DYYII2，北京六一儀器廠)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（MR2000型，南京思騰醫(yī)療器械有限公司）；微量進(jìn)樣器。1.2  方法1.2.1  免疫抗原的制備  耐甲氧西林金黃色葡萄球菌經(jīng)接種，搖瓶傳代擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集MRSA，用生理鹽水反復(fù)洗滌3次，離心收集置于0.4%（）的甲醛溶液中，于37 24 h滅活，用pH7.0 的0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次，將菌液調(diào)成2×109/mL備用。取等量的菌液和不完全

10、福氏佐劑(羊毛脂液體石蠟=73)混合，每毫升混合液中加入卡介苗2.5 mL，充分乳化后作為免疫抗原備用。1.2.2  母雞免疫  12只產(chǎn)蛋母雞隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組6只。實(shí)驗(yàn)組每只每次注射1 mL免疫原，同時(shí)注射4個(gè)部位:雙翅膀皮下和左右背部皮下注射，每周1次，連續(xù)注射3周。免疫后第16天測(cè)定雞血清IgG效價(jià)(>12 000)，第21天開始揀取免疫蛋。對(duì)照組用相同方法注射生理鹽水。以后每月強(qiáng)化免疫1次。1.2.3  抗MRSA卵黃免疫球蛋白(IgY)的分離和純化  采用改良水稀釋法(WD)5。步驟如下

11、：打蛋分離收集蛋黃液。以6倍雙蒸水稀釋蛋黃液，調(diào)節(jié)pH值為5.5，4 冰箱放置過夜。離心，棄去沉淀收集上清液。鹽析：上清液中加入硫酸銨，使硫酸銨的飽和度達(dá)45%，置4 冰箱靜置8 h。離心，棄去上清液，沉淀物按每毫升卵黃液加5 mL PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH7.0)溶解。透析：將溶解液裝入透析袋對(duì)蒸餾水透析除NH4+，最后一次改用對(duì)PBS緩沖液透析。透析液除菌過濾，即得IgY提取液。1.2.4  IgY的抗原性鑒定  用Western blot免疫印跡法，二抗為HRP酶標(biāo)兔抗雞IgG。1.2.5  IgY的含量測(cè)定&#

12、160;    采用260 nm和280 nm雙波長紫外分光光度法。取2只小試管，甲管加入1.5 mL IgY提取液、1.5 mL蒸餾水，乙管加入3 mL蒸餾水，測(cè)定樣品在280 nm、260 nm的吸收值。計(jì)算公式：提取液中IgY濃度（mg/mL ）=1.45A280-0.74A260。1.2.6  IgY純度測(cè)定  采用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠電泳法測(cè)定6。凝膠染色后掃描顯示其純度。1.2.7  IgY的穩(wěn)定性測(cè)定  用ELISA法。1.2.7.1 

13、 IgY提取液的預(yù)處理  熱處理：分別于25、37、50、60、70、80 水浴內(nèi)處理15 min。酸堿處理：分別置于pH114，室溫處理3 h。1.2.7.2  穩(wěn)定性檢測(cè)  用ELISA法，將上述處理過的IgY提取液稀釋1 000倍后按下列步驟進(jìn)行ELISA檢測(cè)：將MRSA用10%（）甲醛固定過夜后用pH8.5碳酸鹽緩沖液稀釋為3×108cfu/mL。包被96孔酶聯(lián)板，4 下放置72  h。依次加入不同預(yù)處理后的IgY稀釋液(每樣品各做2孔)；兔抗雞IgG(稀釋濃度11 000)；底物液顯色

14、30 min后滴加1滴2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。490 nm比色。檢測(cè)所用洗滌液為0.05%Twen20、pH7.4、0.001 mol/L PBS，陽性對(duì)照為未處理IgY稀釋液，陰性對(duì)照為未免疫雞蛋卵黃提取液物。  結(jié)果與分析2.1  IgY的抗原性    蛋黃提取物和雞血清經(jīng)免疫印跡試驗(yàn)，顯示二者均在高分子量附近出現(xiàn)單一的特異性酶染色條帶，說明卵黃提取物和雞血清中目的條帶均為雞IgG分子，具有相同的抗原性。表明卵黃中的IgY為雞血清中IgG傳輸而來，并且雞血清中的IgG與IgY分子量相同。有報(bào)道7，8雞血清IgG分子量為180

15、kD，由6770 kD的重鏈和2230 kD的輕鏈形成四聚體。IgY中的重鏈有4個(gè)穩(wěn)定區(qū)，而哺乳動(dòng)物IgG的重鏈只有3穩(wěn)定區(qū)，IgY多出的一個(gè)穩(wěn)定區(qū)為絞鏈區(qū)。見圖1。2.2  IgY含量    提取液經(jīng)280 nm和260 nm波長測(cè)定出蛋白的含量平均為13.83 mg/mL蛋黃液。2.3  IgY純度    如圖2所示，經(jīng)SDSPAGE電泳，卵黃液提取物基本呈現(xiàn)為一條帶,通過凝膠掃描顯示其純度高達(dá)95%。    雞血清中該帶純度不足50%，且含有較多低分子量和高分子量帶，見圖3。1-2: 蛋黃

16、IgY;  3-4: 雞血清IgG圖1  IgY抗體免疫印跡（略）Fig.1  Western blot of IgY圖2  IgY的SDSPAGE電泳(從13加樣逐漸減少)（略）Fig.2  SDSPAGE electrophoresis of IgY with reducing samples from lane 1 to lane 31-2:雞血清IgY;   3-4:雞蛋黃IgY圖3  雞血清和IgY的SDSPAGE電泳（略）Fig.3 

17、 SDSPAGE electrophoresis of chicken serum and IgY2.4  溫度對(duì)IgY穩(wěn)定性的影響    以溫度為橫軸，ELISA吸光值為縱軸，各溫度熱處理后的吸光值見圖4。    從曲線中可以看出，在低于65 時(shí)，IgY具有較良好的熱穩(wěn)定性，IgY活性下降甚微。超過65 時(shí)IgY活性開始明顯下降，超過70 時(shí)IgY的活性迅速喪失。2.5  pH對(duì)IgY穩(wěn)定性的影響       IgY經(jīng)不同pH條件處理后的抗原結(jié)合活性見圖5。在pH

18、11后活性開始下降，在pH>12時(shí)，IgY迅速失去活性。說明IgY具有較強(qiáng)的耐酸堿性，在中性、弱酸、弱堿環(huán)境中十分穩(wěn)定。圖4  IgY的熱穩(wěn)定性（略）Fig.4  Heat stability of IgY圖5  IgY的酸堿穩(wěn)定性（略）Fig.5  pH stability of IgY3  討論         通常應(yīng)用于研究和診斷的多克隆抗體,傳統(tǒng)方法是從免疫哺乳動(dòng)物(特別是兔子)的血液中分離提取?，F(xiàn)在也能夠從免疫母雞所產(chǎn)蛋

19、的蛋黃中獲取，這種技術(shù)替代傳統(tǒng)的采血技術(shù)生產(chǎn)抗體，不僅可獲取更有效的抗體，而且對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激也最小。利用免疫母雞生產(chǎn)多克隆抗體IgY的過程稱為IgY技術(shù)，包含母雞飼養(yǎng)、免疫過程、產(chǎn)蛋收集、IgY分離提取等程序9。目前IgY生產(chǎn)技術(shù)上的問題已經(jīng)得到克服，方法簡單實(shí)用。    本研究提取出的MRSA  IgY，實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有良好的耐熱、耐酸堿的理化特性。IgY抗體安全環(huán)保、來源豐富、造價(jià)低、抗體含量高、特異性強(qiáng)，可作為診斷試劑應(yīng)用于早期、快速、靈敏診斷疾病或感染。耐甲氧西林的金色葡萄球菌(MRSA)，其致病性強(qiáng)，在全球范圍內(nèi)感染率不斷增加,成為包括泌尿系統(tǒng)在內(nèi)的

20、各種感染的重要致病菌之一，也是引起院內(nèi)感染的重要致病菌10。臨床上，將萬古霉素作為治療MRSA感染的首選藥物，但萬古霉素有較強(qiáng)的不良反應(yīng)，且隨著MRSA感染的迅速增加和萬古霉素的用量增加，已出現(xiàn)了對(duì)萬古霉素產(chǎn)生耐藥的MRSA11，因此在治療上十分棘手?？鼓图籽跷髁纸瘘S色葡萄球菌IgY有可能為臨床治療MRSA感染提供新的手段，具有一定的應(yīng)用前景?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 任平國,徐啟紅.雞卵黃免疫球蛋白（IgY）分離純化的研究J.現(xiàn)代食品科技,2007,23（11）：24-26.2 江千舟.雞卵黃免疫球蛋白（IgY）的分離、純化方法研究進(jìn)展J.國外醫(yī)學(xué)：預(yù)防、診斷、治療生物制品分冊(cè)，2000，23（4）：168-171.3 TERZOLO H R. Agglutination of hen egg yolk immunoglobulins (IgY) against salmonella enterica, serovar enteritidis J.Rev Argent Microbiol,1998,30(2):84.4 HANSEN P, SCOBLE J A. Isolation and purification of immunoglobulins