二至丸對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作用的活性組分構(gòu)件研究

1、二至丸對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作用的活性組分構(gòu)件研究         【關(guān)鍵詞】  二至丸；中藥復(fù)方組合化學(xué)；血清藥理學(xué)；細(xì)胞藥理學(xué)；免疫調(diào)節(jié)；活性組分構(gòu)件摘要：目的探討二至丸免疫調(diào)節(jié)作用的活性組分構(gòu)件。方法運(yùn)用中藥復(fù)方組合化學(xué)、血清藥理學(xué)和細(xì)胞藥理學(xué)方法，觀察女貞子、墨旱蓮系列提取物及其組合物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用。結(jié)果女貞子乙醇提取物、墨旱蓮乙醇提取物、女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（11）具有較強(qiáng)的絲裂原樣作用，可以促進(jìn)小鼠外周血、脾淋巴細(xì)胞增殖和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。結(jié)論二至丸對(duì)小鼠

2、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作用的活性組分構(gòu)件是女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（11）。關(guān)鍵詞：二至丸；  中藥復(fù)方組合化學(xué)；  血清藥理學(xué)；  細(xì)胞藥理學(xué)；  免疫調(diào)節(jié)；  活性組分構(gòu)件Study of Active Components with Immunoregulation from Erzhi Pill on Lymphocytes and Macrophages in MiceAbstract：ObjectiveTo study the active components with immunoregulation from Erzhi

3、 Pill.MethodsDifferent extractions were extracted from Ligustrum lucidum Ait.（LLA）or Eclipta prostrata L.（EPL） with different solvents such as water,alcohol etc.The effect on lymphocytes and macrophages in mice was observed with the methods of Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese P

4、rescriptions, blood serum pharmacology and cytopharmacology.ResultsDifferent extraction showed different effects on mice lymphocytes and macrophages in vitro.The alcohol extraction from LLA (NYC),the alcohol extraction from EPL (HYC) or both (11) could stimulate the mouse lymphocytes proliferation o

5、f peripheral blood and spleen and enhance the phagocyteses of mice macrophages.ConclusionThe active components with immunoregulation from Erzhi Pill on lymphocytes and macrophages in mice was the mixture of NYC and HYC (11).Key words：Erzhi Pill;   Combinatorial Chemical research of Traditi

6、onal Chinese Prescriptions;   Blood serum pharmacology;   Cytopharmacology;   Immunoregulation;   Active components   二至丸是中醫(yī)臨床的經(jīng)典名方，醫(yī)便（明王三才）記載：“二至丸，清上補(bǔ)下第一方，價(jià)廉而功極大?！?它由女貞子、墨旱蓮各等份組成，組方簡單，藥性平和，功效確切，作為補(bǔ)益肝腎良藥。數(shù)百年來，倍受歷代醫(yī)家推崇?，F(xiàn)代還用于衰老、神經(jīng)衰弱、疲勞綜合癥及更年期綜合癥等疾病的治療。

7、中成藥二至丸先后被歷版中國藥典（部）和“第二批國家非處方藥目錄”收載。一些學(xué)者相繼從現(xiàn)代藥理學(xué)角度對(duì)其進(jìn)行了研究，證明二至丸對(duì)機(jī)體免疫功能具有多方面的調(diào)節(jié)作用，但研究中多以水煎劑、女貞子多糖及方中單味藥提取物給藥25。由于目前對(duì)其復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理還缺乏系統(tǒng)規(guī)范的研究，致使制劑工藝粗放，日用劑量過大6，劑型落后，不符合現(xiàn)代中藥要求，影響了它的公眾認(rèn)知度。作者在遵從復(fù)方配伍規(guī)律的前提下，以活性評(píng)價(jià)為導(dǎo)向，運(yùn)用中藥復(fù)方組合化學(xué)、血清藥理學(xué)和細(xì)胞藥理學(xué)方法，對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用的有效組分構(gòu)件進(jìn)行探討，以期進(jìn)一步組成精簡方劑，從而為二至丸的二次開發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1  材料與

8、方法1   材料1.1   動(dòng)物普通級(jí) KM種小鼠，8周齡，體重2224 g，購于重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究室（許可證號(hào)：310101001）。1.2   試劑RPMIl640培養(yǎng)液 (Gibco產(chǎn)品)、無酚紅 RPMIl640培養(yǎng)液 (Sigma產(chǎn)品)，配制時(shí)加青霉素1×105  IU/L、鏈霉素100 mg/L，過濾，使用時(shí)加體積分?jǐn)?shù)為15% 的胎牛血清（FBS，超級(jí)，杭州四季青生物工程材料研究所）。ConA(刀豆蛋白A)，F(xiàn)luka產(chǎn)品；LPS(脂多糖)，Sigma產(chǎn)品，用 RPMI1640配成1 mg/m

9、l，0.22 m過濾，分裝，20凍存，臨用前稀釋。MTT(噻唑藍(lán))，Sigma產(chǎn)品，使用前用 PBS配制成5 mg/ml，過濾，4避光保存。硫代羥基乙酸鈉 (thioglyc011ate，TG)，北京生物制品所產(chǎn)品。其余試劑均為市售分析純。1.3  儀器Napco6lOO型CO2培養(yǎng)箱，美國。96孔板，Nunclon，丹麥。微量可調(diào)加樣器，Labsystems，芬蘭。多頭細(xì)胞收集儀，ZT型，上海醫(yī)科大學(xué)。550型酶標(biāo)儀，BioRad，美國。恒溫水浴搖床，Yamato，日本。1.4   藥物女貞子 Ligustrum lucidum Ait.（LLA）、墨旱蓮 E

10、clipta prostrata L.（EPL），購于重慶市中藥材公司，符合中國藥典2005年版部規(guī)定。2   方法2.1   女貞子、墨旱蓮提取物的制備取女貞子或墨旱蓮藥材，粉碎，過20目篩，依次用不同溶劑，10倍量提取2次，2 h/次，過濾，合并提取液，回收溶劑，制備女貞子或墨旱蓮的石油醚提取物（簡稱 NSYM或 HSYM）、醋酸乙酯提取物（簡稱 NYSYZ或 HYSYZ）、乙醇提取物（簡稱 NYC或 HYC）和水煎煮提取物（簡稱 NSJZ或 HSJZ）。臨用前，分別用生理鹽水（NS）制備藥液，必要時(shí)可加少量 Tween80助溶，濃度相當(dāng)于1 mg生

11、藥/ml。2.2   含藥血清的制備7小鼠按體重隨機(jī)分組，每組10只，雌、雄各半。ig給藥，給藥2次，間隔2 h。ig容積10 ml/kg，空白血清組ig  NS，各含藥血清組 ig相應(yīng)組分6.7 g生藥 /kg（組合組分13.4 g生藥 /kg）。末次給藥1 h，深度麻醉，心臟無菌采血，3000 r/min離心10 min，收集血清。同組分血清混合，56水浴30 min，-20凍存，臨用前4凍融。2.3   細(xì)胞懸液的制備8小鼠腹腔注射3% TG溶液（2 ml/只），72h后眼眶采血（肝素500 IU/ml抗凝），隨即脫頸椎處死小鼠，ip P

12、BS 5ml，收集腹腔洗液，同時(shí)無菌取脾。常規(guī)方法制備細(xì)胞懸液，PBS液洗滌，離心，細(xì)胞沉淀加入 RPMI164010% FBS培養(yǎng)液，調(diào)整濃度為2×106 cells/ml，臺(tái)盼蘭排除法檢查細(xì)胞存活率大于95%。2.4   淋巴細(xì)胞增殖（lymphocytes proliferation，LP）實(shí)驗(yàn)996孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各給藥組每孔加入50l淋巴細(xì)胞懸液、20 l含藥血清和120 l RPMI164010%FBS培養(yǎng)液（對(duì)照組、刺激組分別用20 l空白血清），混勻后預(yù)孵1 h，再加入10 l ConA或 LPS（終濃度為5 g/ml）刺激（對(duì)照組用10 l PBS

13、），各設(shè)8個(gè)復(fù)孔。5% CO2培養(yǎng)箱（Forma.USA）37培養(yǎng)48 h后，加入 MTT 10 l/孔（10 mg/ml）培養(yǎng)8 h，棄上清，加入 DMSO 100 l/孔，MTT結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定A值。2.5   腹腔巨噬細(xì)胞（PM）吞噬活性實(shí)驗(yàn)1096孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各給藥組每孔加入50 l腹腔巨噬細(xì)胞懸液、20 l含藥血清和120 l無酚紅 RPMI164010% FBS培養(yǎng)液（對(duì)照組用20 l空白血清），各設(shè)8個(gè)復(fù)孔。5% CO2培養(yǎng)箱（Forma.USA）37培養(yǎng)24 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加0.075%中性紅溶液100 l/孔，培養(yǎng)1 h，棄上

14、清液，預(yù)溫的 PBS液洗3遍，加入細(xì)胞溶解液（0.1 mol/L乙酸：無水乙醇）100 l/孔，室溫放置，過夜。次日，取上清液于酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀540 nm處測(cè)定A值。2.6   統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包。運(yùn)用單向方差分析（OneWay ANOVA），選用 Dunnett法進(jìn)行組間顯著性分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。         1  操紅纓，梁頌名，榮向路，等二至丸對(duì)陰虛模型神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用的研究J.中藥材，2000，23（2）：166.2

15、60; 段曉春旱蓮草的研究概況J.中國臨床醫(yī)藥實(shí)用雜志，2004，(12)：59.3  李葆華女貞子的研究狀況J.中華醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐，2004，2(7)：49.4  李磷，丁安偉，孟麗二至丸免疫調(diào)節(jié)作用活性部位的研究J.中醫(yī)藥研究，2002；18(5)：42.5  劉大基，劉解生，徐繼勛，等二至丸對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用J.湖北中醫(yī)雜志，2002，24(2)：48 .6  國家藥典委員會(huì)中國藥典，部S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：293.7  姚干，彭成，周東，等大川芎方對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷的保護(hù)作用M中成藥，2004，26（4）：315.8  路景濤，楊雁，陳敏珠黃芪多糖對(duì)細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF、NO及IL1的影響J安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39(2)：140.9  徐建芬，陳學(xué)群，杜繼曾間斷性低氧對(duì)大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響J中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2005，21(1)：5.10  梁文杰，劉東青，單保恩，等北豆根提取物對(duì)小鼠和人淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞作用的體外實(shí)驗(yàn)研究J中國免疫學(xué)雜志，2005，21(1)：56.11  周麗娟，許利平中藥抗炎免疫藥理免疫調(diào)節(jié)研究進(jìn)展J中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2004，10（1）：79.