中華眼鏡蛇毒對(duì)人類小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株增殖周期及細(xì)胞凋亡的

1、中華眼鏡蛇毒對(duì)人類小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株增殖周期及細(xì)胞凋亡的影響         09-09-07 16:28:00     編輯：studa20                 作者：劉成軍，韋世秀，李牡艷，吳華，李佳荃【摘要】  目的探討中華眼鏡蛇毒（Chinese cobra venom）對(duì)體外培養(yǎng)的人

2、類小涎腺腺樣囊性癌(NACC)細(xì)胞株誘導(dǎo)凋亡的作用。方法應(yīng)用三磷酸腺苷-生物熒光腫瘤化療藥物敏感實(shí)驗(yàn)法（ATP-TCA）測定細(xì)胞的生長抑制百分率，倒置相差顯微鏡、HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率。結(jié)果ATP-TCA實(shí)驗(yàn)顯示眼鏡蛇毒對(duì)體外培養(yǎng)的NACC細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，與濃度和作用時(shí)間呈正比；形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)用藥后的NACC細(xì)胞質(zhì)空泡、核固縮、核染色質(zhì)聚集等形態(tài)學(xué)變化現(xiàn)象；流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒阻滯NACC細(xì)胞生長于細(xì)胞周期的G0G1期，檢測到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組。結(jié)論中華眼鏡蛇毒能抑制NACC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)NACC細(xì)胞凋亡。 【關(guān)鍵詞】

3、0; 中華眼鏡蛇毒 NACC細(xì)胞株 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡Abstract：Objective To study on the effect of Chinese cobra venom-induced apoptosis in Noovel Human palatal salivary gland cells line. MethodsThe adenosine triphospate(ATP)-bioluminescence tumor chemosensitivity assay (ATP-TCA) was used to examine the growth of NACC cells t

4、reated with Chinese cobra venom in different concentration.Cell apoptosis was observed by flow cytometry and cell morphology. ResultsThe experiment showed that cobra venom could obviously inhibit the growth of NACC cell in a concentration and time-dependent manner.The changes in morphology of NACC C

5、ell were observed by HE staining. The flow cytometry analysis showed that apoptosis and inhibition of NACC cells in the G0/G1 phase were induced after treated with Chinese cobra venom. The apoptotic rates of NACC cells treated with Chinese cobra venom groups were significantly higher than that in co

6、ntrol group. ConclusionCobra venom can inhibit proliferation and induce apoptosis of NACC cells.Key words：Chinese cobra venom;    NACC cell;   Cell cycle;  Cell apoptosis    涎腺腺樣囊性癌是最常見的涎腺惡性腫瘤之一，研究有效藥物控制其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為目前研究的熱點(diǎn)。中華眼鏡蛇毒中成分復(fù)雜，其主要成分有神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素、酶、蛋白質(zhì)及多肽

7、等。具有多方面的藥理作用，如抗炎、抗血小板聚集、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等。隨著蛇毒毒理學(xué)、藥物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來國內(nèi)外學(xué)者越來越重視蛇毒抗腫瘤作用的研究。據(jù)報(bào)道眼鏡蛇毒在體內(nèi)體外都具有抗腫瘤作用13。而眼鏡蛇毒對(duì)NACC細(xì)胞株的作用如何，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。在本研究中，我們嘗試應(yīng)用近年發(fā)展起來的對(duì)惡性實(shí)體腫瘤有較高可評(píng)估率的新方法三磷酸腺苷-生物熒光腫瘤化療藥物敏感實(shí)驗(yàn)法（ATP-TCA法）4，研究眼鏡蛇毒對(duì)人類小涎腺腺樣囊性癌(NACC)細(xì)胞株的抑制作用，測定眼鏡蛇毒與癌細(xì)胞存活的量效和時(shí)效關(guān)系，應(yīng)用HE染色觀察眼鏡蛇毒作用NACC細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，以及流式細(xì)胞術(shù)檢測眼鏡蛇毒作

8、用后的NACC細(xì)胞凋亡等方面的實(shí)驗(yàn)，為眼鏡蛇毒的抗腫瘤臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  材料與方法1.1  藥品與儀器中華眼鏡蛇毒凍干粉（廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所）；ATP試劑盒德國DCS公司，包括：完全分析培養(yǎng)基（CAM）、ATP提取液、熒光素-熒光酶、稀釋緩沖液、ATP標(biāo)準(zhǔn)品、96孔檢測板、針管、過濾器、過濾膜等;胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）;青霉素（哈藥集團(tuán)制藥總廠）;鏈霉素(大連美羅大藥廠)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國Hyclone)。微孔板式自發(fā)光分析儀（德國BETHOLD公司）；水套式CO2培養(yǎng)箱（美國 FORMA 公司）；流式細(xì)胞儀（ 美國 BECKM

9、AN COULTER公司 ）；倒置相差顯微鏡（德國ZELSS公司）；病理圖象分析儀（德國LEICA公司）。1.2  細(xì)胞株人類小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株（廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院）。1.3  人類小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的培養(yǎng)將人類小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)于含10%胎牛血清，青霉素100 u/ml和鏈霉素100 g/ml的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期人類小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞用0.125%胰酶消化后收集細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，加入完全分析培養(yǎng)基（CAM）制成1×105/ml細(xì)胞懸液。1.4  ATP-TCA

10、法測定人類小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞增殖的抑制率 將眼鏡蛇毒凍干粉，用完全分析培養(yǎng)基（CAM）溶解，倍比稀釋成100，50，25，12.5，6.25 g/ml的不同濃度蛇毒溶液，每種蛇毒濃度各取100 l分別置96孔板中，每個(gè)蛇毒濃度組設(shè)4個(gè)復(fù)孔作為實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)未加蛇毒孔作為對(duì)照組。于各孔中加入1×105/ml的細(xì)胞懸液100 l，置5%CO2，37飽和濕度培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24，48，72，96 h，然后向各孔中加入ATP提取液50 l，多次吸取混勻，避免產(chǎn)生氣泡，室溫下孵育5 min。從各孔中吸取50 l培養(yǎng)液，置96孔檢測板中，在每個(gè)檢測孔中加入50 l熒光素-熒光素酶測試試劑，充分混

11、勻，在微孔板式自發(fā)光分析儀上進(jìn)行ATP熒光測定。根據(jù)含藥孔的熒光值與無藥孔的熒光值的比較，得出該濃度藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制值，作出蛇毒劑量-抑制曲線。     依據(jù)下式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長抑制（TGI）百分率：     抑制率（%）=1-F試驗(yàn)組F對(duì)照組×100%1.5  NACC細(xì)胞周期及凋亡率的測定對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用0，5，10，20 g/ml蛇毒分別作用24 h，用胰酶消化后，收集2×106個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌1次，加入70乙醇4固定過夜。離心棄乙醇，PBS洗滌1次后加入RNA酶(1

12、mgml)240 l。37水浴30 min后，加入PI綜合染液(PI濃度為124 g/ml，Triton X-100濃度為0.124)1 ml，4避光染色30 min，用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞，結(jié)果采集用SYSTEM 軟件，細(xì)胞周期分析采用MultiCycle軟件。1.6  細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察將NACC接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，設(shè)蛇毒（25 g/ml）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，在相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察藥物對(duì)癌細(xì)胞的影響。同時(shí)在培養(yǎng)皿中放置無菌蓋玻片培養(yǎng)制備細(xì)胞爬片光鏡標(biāo)本，HE染色觀察。1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，以SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差檢驗(yàn)。2  結(jié)果2.1  蛇毒對(duì)人類小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的抑制作用 不同濃度的蛇毒對(duì)體外生長的NACC細(xì)胞有明顯的抑制作用，且隨著蛇毒濃度升高而增