標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量一、 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)一般用分光光度法測(cè)物質(zhì)的含量，先要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出所測(cè)物質(zhì)的含量。因此，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是生物檢測(cè)分析的一項(xiàng)基本技術(shù)。二、 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法1、 凱氏定氮法2、 雙縮脲法3、 Folin-酚試劑法4、 紫外吸收法5、 考馬斯亮藍(lán)法三、 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作（一）、試劑：1、 考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸餾水稀釋至1000ml,濾紙過(guò)濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）

2、H3PO4。2、 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：純的牛血清血蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。（二）、器材：1、722S型分光光度計(jì)使用及原理（）。2、移液管使用（）。（三）、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：試管編號(hào)0123456100ug/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/L NaCl （ml）10.90.80.70.60.50.4考馬斯亮藍(lán)試劑 （ml）5555555搖勻，1h內(nèi)以1號(hào)管為空白對(duì)照,在595nm處比色A595nm1、2、以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)（六個(gè)點(diǎn)為10ug、2

3、0 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。1）、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出回歸方程。2）、用公式計(jì)算回歸方程。3）、或用origin作圖 ，測(cè)出回歸線(xiàn)性方程。即A595nm=a×X( )+6一般相關(guān)系數(shù)應(yīng)過(guò)0.999以上，至少2個(gè)9以上。4）、繪圖時(shí)近兩使點(diǎn)在一條直線(xiàn)上，在直線(xiàn)上的點(diǎn)應(yīng)該在直線(xiàn)兩側(cè)。（四）、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：樣品即所測(cè)蛋白質(zhì)含量樣品（含量應(yīng)處理在所測(cè)范圍內(nèi)），依照操作步驟1操作，測(cè)出樣品的A595nm，然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或回歸方程求出樣品蛋白質(zhì)含量。一般被測(cè)樣品的A595nm值在0.10.05之間，所以上述樣品如果A595nm值太大，可以

4、稀釋后再測(cè)A595nm值，然后再計(jì)算。（五）、注意事項(xiàng)：1、 玻璃儀器要洗滌干凈。2、 取量要準(zhǔn)確。3、 玻璃儀器要干燥，避免溫度變化。4、 對(duì)照：用被測(cè)物質(zhì)以外的物質(zhì)作空白對(duì)照。藥品的配制（磷酸緩沖液的配制）一、藥品的配制步驟（一）、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：1、 準(zhǔn)備所需的藥品和玻璃儀器。2、 洗滌。（怎樣洗滌算干凈？）（二）、計(jì)算：1、百分比濃度計(jì)算：1)、G/V比例如配1% NaCl，稱(chēng)1g NaCl溶于100ml 水。2）、V/V比：例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml。取75ml無(wú)水乙醇，加25ml蒸餾水。乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配50

5、0ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。3）G/V比：用的較少，如計(jì)算灰分中某種元素如Fe的含量。2、摩爾濃度計(jì)算：注：藥品的分子量一般在標(biāo)簽中注明。1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。M=質(zhì)量/體積（L）稱(chēng)取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩爾數(shù)=G（g）/摩爾質(zhì)量2）、0.1mMNaCl配100mlmM=毫摩爾數(shù)/體積（L） 稱(chēng)取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 毫摩爾數(shù)=G（mg）/摩爾質(zhì)量3）、0.1uNaCl配100mlmM=微摩爾數(shù)/體積（L） 稱(chēng)取NaCl0.1×0.1×

6、;40=0.4mg微摩爾數(shù)=G（ug）/摩爾質(zhì)量 稱(chēng)取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug 3、 混合溶液配制的計(jì)算：如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸緩沖液配制。注意：1、分別標(biāo)定體積計(jì)算2、分別配制再混合，但總體積不能 為100ml（三）、標(biāo)量：1、 根據(jù)需要選擇不同量程的天平根據(jù)要求去不同精度的測(cè)量器，如量筒或移液管。2、 電子分析天平的使用。（四）、溶解：1、 根據(jù)藥品配置要求選擇溶劑。蒸餾水，雙蒸水，無(wú)離子水等。2、 只能用燒杯溶解。注意加入溶劑只能加入總體積的2/3左右，剩余溶劑洗滌燒杯三次左右，直到洗滌干凈

7、。小常識(shí)：藥品標(biāo)簽中一般標(biāo)識(shí)有藥品的溶解性能和分子式，可根據(jù)分子式和所學(xué)的常識(shí)判斷藥品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)特點(diǎn)（包括溶解性質(zhì)）。如酸堿兩性物質(zhì)的配制（AA、蛋白質(zhì)、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀堿促進(jìn)溶解，但pH應(yīng)在被要求的范圍內(nèi)。3、 加熱促進(jìn)溶解，但注意應(yīng)在配制的范圍內(nèi)有的藥品還需水溶加熱較好。如:配0.1%的淀粉，水裕加熱（溫度在80-90。C），過(guò)量會(huì)糊化。（五）、定容：1、 用容量瓶定容；2、 用玻璃棒引流或用小漏斗；3、 用溶劑加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。要求刻度與液體凹面相切為止（眼睛可視）；4、 上下窯洞容量瓶幾次，混合均勻即可。(注意不再定容了，防止溶液漏掉。)（

8、六）、裝入試劑瓶，貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽應(yīng)注明以下內(nèi)容：藥品濃度、名稱(chēng)、配制人、配制日期等。（七）、清理實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所。二、磷酸緩沖液的配制。（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸緩沖液。用磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉做緩沖液。選用藥品：Na2HPO4·12H2O（堿）和NaH2PO4·12H2O（酸）配緩沖液100ml。書(shū)中說(shuō)明。（二）、計(jì)算 ：1、 注：書(shū)中有注明配置的量。2、 計(jì)算：Na2HPO4·12H2O稱(chēng)取71.64×0.1=7.164gNaH2PO4·12H2O稱(chēng)取 31.21×0.1=3.121g3、 含有不同結(jié)晶水的換算。書(shū)中配1/15mol/L的緩沖液配1L，書(shū)中用Na2HPO4·2H2O需要11.87g/L但用Na2HPO4·12H2O需多少g？11.87=（178/358）×X，X=23.87g。（三）、分別配制緩沖液各100ml（根據(jù)需要確定配制的量）。即：0.2M Na2HPO4·2H2O和NaH2PO4·2H2O100ml。（四）、按書(shū)中的量配制取量再混合。如：pH=6.8，分別去緩沖對(duì)49ml和51ml。（五）、用pH試紙ceni索賠的緩沖液的p