林氏咽寧散體外抗金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)(一)

1、林氏咽寧散體外抗金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)(一)    【關(guān)鍵詞】 林氏咽寧散；,金黃色葡萄球菌；,抗菌實(shí)驗(yàn)摘要：目的探討林氏咽寧散體外對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。方法以微生物試驗(yàn)瓊脂平皿法、液體試管法觀察其抗菌作用。結(jié)果對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用。瓊脂平皿法最低抑菌濃度（MIC）為0.1 g/ml，液體試管法最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）均為0.025 g/ml。結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，林氏咽寧散體外抗菌活性測(cè)定顯示，對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抗菌作用，與其相關(guān)的臨床功能主治相符，為其臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：林氏咽寧散； 金黃色葡萄

2、球菌； 抗菌實(shí)驗(yàn)林氏咽寧散系采用著名老中醫(yī)祖?zhèn)鹘?jīng)驗(yàn)方，運(yùn)用先進(jìn)工藝制成的純中藥散劑。主要有鳳凰衣、藏青果、薄荷葉、人工牛黃、珍珠粉、冰片、黃柏等10味中藥組成。用于治療急慢性咽炎等。本實(shí)驗(yàn)對(duì)林氏咽寧散進(jìn)行體外抗金葡菌實(shí)驗(yàn)，為臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1 材料1.1 藥品林氏咽寧散（常州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，批號(hào)050829 ， 鈷60輻射滅菌），青霉素V鉀片0.25 g（Sandoz GmbH,KundlAustria，批號(hào)133590），錫類散（江蘇天士力制藥有限公司，批號(hào)0502002）。1.2 菌種金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusCMCC(B)26003(中國(guó)藥品生

3、物制品檢定所)。1.3 培養(yǎng)基11.3.1 MuellerHinton（M-H）肉湯培養(yǎng)基成分：牛肉浸膏3 g，純水1 000 ml，可溶性淀粉1.5 g，酪蛋白水解物17.5 g。制法：將上述各成分混合，搖勻，調(diào)pH至7.4，分裝，滅菌，備用。1.3.2 MuellerHinton瓊脂（MHA）培養(yǎng)基成分：M-H肉湯1000 ml，瓊脂17 g。制法：將瓊脂加入M-H肉湯內(nèi)，加熱溶解，分裝，滅菌，備用。2 方法與結(jié)果2.1 最小抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定2.1.1 平皿二倍稀釋法1采用瓊脂稀釋法，用MuellerHinton瓊脂（MHA）培養(yǎng)基對(duì)林氏咽寧散進(jìn)行定量抗金葡

4、菌試驗(yàn)。2.1.1.1 藥液稀釋稱取林氏咽寧散6 g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液30 ml振搖，混勻，即為0.2 g/ml供試液。取青霉素V鉀片1片，研磨，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解并稀釋至0.000 025 g/ml（相當(dāng)于青霉素V 42.375 u/ml）的溶液，作為藥物對(duì)照液。取錫類散3 g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液15 ml振搖，混勻，即為0.2 g/ml的對(duì)照液。取無(wú)菌空試管6支，第1管中放入林氏咽寧散供試液（0.2 g/ml），第26管中分別加5 ml pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，于第1管中取出5 ml放入第2管中，混勻，即為0.1 g/

5、ml的供試液，同法從第2管取出5 ml放入第3管，如此連續(xù)稀釋至第6管，供試溶液的含藥濃度依次為：0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25 g/ml。取無(wú)菌空試管 6 支，同法將錫類散依次稀釋成0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25 g/ml的溶液。2.1.1.2 含藥平皿制備分別取上述供試液與對(duì)照液1 ml加入無(wú)菌平皿中，然后分別加入相同量的MuellerHinton瓊脂（MHA）培養(yǎng)基15 ml，充分搖勻，開(kāi)蓋，在凈化臺(tái)上適當(dāng)消除冷凝水，待培養(yǎng)基凝固。同一濃度的藥液平行做2個(gè)平板。用吸管吸取0.1 ml金黃色葡萄球菌稀釋液（金葡

6、菌濃菌液用滅菌的0.9氯化鈉溶液10倍系列稀釋至10-3，經(jīng)測(cè)定活菌數(shù)為82 000 cfu/ml）于上述各平板上，用接種棒均勻涂抹于整個(gè)平板。同時(shí)設(shè)一份不含藥物的MuellerHinton瓊脂（MHA）培養(yǎng)基平板作為陽(yáng)性菌生長(zhǎng)對(duì)照；一份含藥物但不含實(shí)驗(yàn)菌的空白對(duì)照；一份pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液與MuellerHinton瓊脂（MHA）培養(yǎng)基混合的稀釋劑對(duì)照。2.1.1.3 培養(yǎng)、觀察結(jié)果將制備好的平板置35培養(yǎng)1824 h后，觀察各平板是否有金葡菌生長(zhǎng)，金葡菌不生長(zhǎng)的最低藥物濃度，即為金葡菌的最低抑菌濃度。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 平皿法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略） 表示試驗(yàn)皿長(zhǎng)菌； 表示試驗(yàn)皿未長(zhǎng)

7、菌結(jié)果證實(shí)，青霉素V鉀對(duì)金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003高度敏感。林氏咽寧散對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，固體平皿法最低抑菌濃度為0.1 g/ml。而錫類散在此系列濃度下對(duì)金葡菌的抑菌作用不明顯。2.1.2 液體試管法1，2采用液體培養(yǎng)基倍比稀釋法，用MuellerHinton（M-H）肉湯培養(yǎng)基對(duì)林氏咽寧散進(jìn)行定量抗金葡菌試驗(yàn)。2.1.2.1 藥液稀釋取無(wú)菌空試管 10 支，于 10 支試管中加入MuellerHinton（M-H）肉湯培養(yǎng)基各1 ml，第1管中加入林氏咽寧散供試液（0.2 g/ml）1 ml，混合后吸取1 ml加入第2管，同法稀釋至第9管，從第9管中取出1 ml于

8、一滅菌空試管中作為空白對(duì)照，不加金葡菌以便觀察供試液是否被污染。則19管的藥物濃度依次為0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25，0.003 12，0.001 56，0.000 78，0.000 39 g/ml。第10管作為陽(yáng)性生長(zhǎng)對(duì)照管。另取一滅菌空試管，分別加入0.5 ml MuellerHinton（M-H）肉湯培養(yǎng)基和pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液作為稀釋劑對(duì)照管。取無(wú)菌空試管 10 支，同法將錫類散依次稀釋成0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25，0.003 12，0.001 56，0.000 78，0.000 39 g/ml

9、的溶液。從第9管中取出1ml于一滅菌空試管中作為空白對(duì)照，不加金葡菌以便觀察供試液是否被污染。取上述青霉素V鉀0.000 025 g/ml（42.375 u/ml）溶液，作為藥物對(duì)照液。2.1.2.2 加入菌液各試驗(yàn)管、陽(yáng)性對(duì)照管加入0.1 ml金黃色葡萄球菌稀釋液（金葡菌濃菌液用滅菌的0.9氯化鈉溶液10倍系列稀釋至10-3，經(jīng)測(cè)定活菌數(shù)為82 000 cfu/ml）。2.1.2.3 培養(yǎng)、觀察結(jié)果將各試驗(yàn)管置35培養(yǎng)1824 h后，取出，備用。將各試驗(yàn)管的培養(yǎng)物分別劃線轉(zhuǎn)種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，35培養(yǎng)1824 h后，觀察各平板是否有金葡菌生長(zhǎng)，金葡菌不生長(zhǎng)的最低藥物濃度，即為金

10、葡菌的最低抑菌濃度（MIC）。分別吸取各試驗(yàn)管的培養(yǎng)物0.1 ml，用接種棒均勻涂抹于整個(gè)甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，35培養(yǎng)1824 h后，觀察各平板上的金葡菌菌落數(shù)，平板上的菌落數(shù)小于5個(gè)的最小稀釋度的藥物濃度即為最低殺菌濃度（MBC）。結(jié)果見(jiàn)表2。表2 液體試管法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略） 表示試驗(yàn)管長(zhǎng)菌； 表示試驗(yàn)管未長(zhǎng)菌結(jié)果證實(shí)，青霉素V鉀對(duì)金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003高度敏感。林氏咽寧散對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，液體試管法最低抑菌濃度（MIC）為0.025 g/ml。最低殺菌濃度（MBC）為0.025 g/ml。而錫類散在此系列濃度下對(duì)金葡菌的抑菌作用不明顯。3 結(jié)論林氏咽寧散體外抗金葡菌試驗(yàn)，平皿二倍稀釋法最低抑菌濃度（MIC）為0.1 g/ml，液體試管法最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）均為0.025 g/ml。因?yàn)橐后w試管法藥液與試驗(yàn)菌體充分接觸，使得試驗(yàn)菌對(duì)藥物較固體法更敏感一些，導(dǎo)致兩法MIC值稍有一些差別，液體試管法的結(jié)果更精確。林氏咽寧