采用重組人源 CYP酶研究艾瑞昔布的體外羥基化代謝-

1、采用重組人源CYP 酶研究艾瑞昔布的體外羥基化代謝李強3,黃海華13,董宇2,鐘大放2(沈陽藥科大學(xué)1.微生物學(xué)教研室,2.藥物代謝與藥物動力學(xué)實驗室,遼寧沈陽110016;3.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春130023摘要:目的探討新型抗炎鎮(zhèn)痛藥艾瑞昔布在人體內(nèi)的羥基化代謝酶。方法用體外重組的人源細(xì)胞色素P450(CYP 進行孵育代謝實驗,液相色譜2多級質(zhì)譜法分析代謝產(chǎn)物和殘留的母體藥物,利用整體歸一化法對4種CYP 酶的代謝作用大小進行評估。結(jié)果艾瑞昔布羥基化代謝可由CYP2C9,CYP2D6和CYP3A4催化,其各自作用大小分別為6215%,2111%和1614%。結(jié)論CYP2C9為艾瑞

2、昔布羥基化的主要代謝酶。關(guān)鍵詞:細(xì)胞色素P450;羥基化代謝;艾瑞昔布;液相色譜2多級質(zhì)譜法;整體歸一化中圖分類號:R969.1;R969.2;Q559.9;R971.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0513-4870(200505-0410-04 收稿日期:2004206218.基金項目:國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃課題(2003AA2Z347C .3通訊作者Tel:86-24-23843711-3795,Fax:86-24-23902539,E 2mail:zhongdfchina .comI nvesti gati on on the hydroxyl ati on met aboli

3、s m of i m recoxi b in vitro by usi n g reco mbi n ant hu man CYPsL IQ iang 3,HUANG Hai 2hua13,DONG Yu 2,ZHONG Da 2fang2(1.D epart m ent of Phar m aceutical M icrobiology, 2.L aboratory of D rug M etabolis m and Phar m acokinetics,Shenyang Phar m aceutical U niversity,Shenyang 110016,China; 3.Colleg

4、e of L ife Science,J ilin U niversity,Changchun 130023,China Abstract:A i m T o identify the drug 2metabolizing enzy mes involved in the hydr oxylati on of the ne w anti 2infla mmat ory and anodyne i m recoxib .M ethods I m recoxib was incubated with heter ol ogous exp ressi on hu cyt ochr o me P450

5、(r CYPs in vitro ,and metabolites and re mained parent drug were detected with liquid chr omat ography 2multistage mass s pectr ometry .The contributi on of 4CYPs in the hydr oxylati on metabolis m of i m recoxib was evaluated by t otal nor malized rate (T NR method .Results I m recoxib is metaboliz

6、ed by CYP2C9,CYP2D6and CYP3A4,with the rate of 6215%,2111%and 1614%,res pectively .Conclusi on CYP2C9is the maj or enzy me involved in i m recoxib hydr oxylati on metabolis m.Key words:cyt ochr ome P450;hydr oxylati on metabolis m;i m recoxib;liquid chr omat ography 2multistage mass s pectr ometry;t

7、 otal nor malized rate艾瑞昔布(i m recoxib,圖1為我國正在研制開發(fā)中的新藥,環(huán)氧化酶22(COX 22特異性抑制劑,對因炎性介質(zhì)引起的環(huán)氧化酶22的生成有較強抑制作用,進而發(fā)揮止痛及抗炎作用1。研究表明,該藥在人體內(nèi)絕大部分以代謝物形式消除,主要代謝途徑是經(jīng)肝臟代謝為42羥基代謝產(chǎn)物M1,尿液中幾乎只能檢測到進一步氧化的42羧基代謝產(chǎn)物M2。I m recoxib:R =CH 3;M1:R =CH 2OH;M2:R =COOHFigure 1Structures of i m recoxib and its mainmetabolites (M1and M2目

8、前國外已經(jīng)上市的同類藥物有羅非昔布(r ofecoxib、伐地昔布(valdecoxib和依他昔布(et oricoxib等,其結(jié)構(gòu)有一定相似性,主要由CYP2C9及CYP3A4代謝2-4。為探討艾瑞昔布在人體內(nèi)的主要代謝酶,本文利用重組人源CYP酶對該藥進行體外代謝研究,通過液相色譜2多級質(zhì)譜(LC2MS n方法檢測其代謝產(chǎn)物,利用整體歸一化(t otal nor malized rate,T NR法對參與代謝CYP亞型的作用進行評估,并對其主要代謝酶的動力學(xué)性質(zhì)進行初步探討。材料與方法藥物代謝重組酶人源重組r CYP2C9, r CYP2C19,r CYP2D6及r CYP3A4購自CHT

9、公司(Salt Lake,美國,于-86低溫冰箱內(nèi)保存。藥品和試劑甲苯磺丁脲(t olbutam ide原料藥,由廣州溫泉藥廠提供;氫溴酸右美沙芬(dextr omethor phan原料藥和S2美芬妥英(S2 mephenyt oin原料藥,均由沈陽藥科大學(xué)藥劑教研室提供;鹽酸咪達(dá)唑侖(m idaz ola m注射劑,羅氏有限公司。艾瑞昔布原料藥,純度為9916%;內(nèi)標(biāo)物BAP910原料藥,純度為9915%,均由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供。其余重組酶孵育體系試劑為市售分析純,用于LC2MS n分析的試劑為色譜純。美國Finnigan公司LCQ型液相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有電噴霧離子化源(ES

10、I離子阱質(zhì)量分析器和日本Shi m adzu LC210AD高效液相輸液泵及Xcalibur111數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);-86低溫冰箱(日本三洋。重組酶孵育體系重組酶孵育體系介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液,濃度為100mmolL-1,pH714,含有重組酶50nmolL-1,因艾瑞昔布不溶于水,孵育時加入甲醇溶液,終濃度為5molL-1,有機相為最終體系的011%(v/v,以加入1mmolL-1NADPH起始反應(yīng),最終體積為200L。在37水浴中孵育,反應(yīng)至一定時間以等體積的冰冷甲醇終止反應(yīng)。每次孵育均為雙樣本。重組CY P酶活力檢測r CYP2C9酶活力檢測用CYP2C9探針?biāo)幬锛妆交嵌‰鍨榈孜?底物濃度為10

11、0molL-1,其余條件同重組酶孵育體系,LC2MS n法以負(fù)離子方式檢測產(chǎn)物42羥基甲苯磺丁脲生成速率,作為r CYP2C9酶活指標(biāo)。r CYP2C19酶活力檢測用CYP2C19探針?biāo)幬颯2美芬妥英為底物,底物濃度為100molL-1,LC2 MS n法以正離子方式檢測42羥基代謝物生成速率。r CYP2D6酶活力檢測用CYP2D6探針?biāo)幬镉颐郎撤覟榈孜?底物濃度為5molL-1,LC2MS n法以正離子方式檢測產(chǎn)物O2去甲基代謝物生成速率。r CYP3A4酶活力檢測用CYP3A4探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖為底物,底物濃度為5molL-1,LC2MS n法以正離子方式檢測產(chǎn)物12羥基咪達(dá)唑侖生成速率。

12、重組酶對艾瑞昔布代謝能力的測定艾瑞昔布在孵育體系中的終濃度為5molL-1,分別與r CYP2C9,r CYP2C19,r CYP2D6和r CYP3A4在37水浴中孵育,各種酶終濃度均為50nmolL-1,用LC2MS n法測定艾瑞昔布42羥基代謝產(chǎn)物M1生成速率。LC2M S n法檢測M1質(zhì)譜條件:電噴霧離子化源,正離子方式檢測。離子源噴射電壓:415k V;毛細(xì)管溫度:200;毛細(xì)管電壓:13V;鞘氣流速: 1105Lm in-1;輔助氣流速:0115Lm in-1;用一級全掃描方式、二級全掃描方式和選擇反應(yīng)監(jiān)測方式。色譜條件:色譜柱為D ia monsil C18柱(200mm416m

13、m I D,5m,北京迪馬公司;流動相為甲醇2水2甲酸(7525011,v/v/v;柱溫:室溫;流速:015 mLm in-1。酶動力學(xué)參數(shù)測定根據(jù)文獻(xiàn)5要求,對艾瑞昔布羥化反應(yīng)的主要代謝酶(代謝程度超過20% r CYP2C9及r CYP2D6進行酶動力學(xué)考察,艾瑞昔布在孵育體系中的終濃度范圍為011-40molL-1,測定M1的生成速率,計算K m,V max。確證酶濃度與速率成線性酶濃度范圍為5-80nmolL-1,艾瑞昔布濃度為5molL-1進行體外孵育,驗證酶濃度與反應(yīng)速率是否成線性關(guān)系。結(jié)果1酶活力檢測對4種r CYP酶進行的酶活力檢測結(jié)果證實,研究所用的重組酶均具有較強酶活力(表

14、1,滿足本研究的要求。Table1The m on itored acti v iti es of4rCY Psr CYP Pr obe substrate reacti onActivity/pmol p r oductm in-1(pmol P450-1 2C9Tolbuta m ide242hydr oxylati on31912C19(S2Mephenyt oin242hydr oxylati on61782D6Dextr omethor phan2O2demethylati on01543A4M idaz ola m212hydr oxylati on01242主要代謝酶對艾瑞昔布代

15、謝能力的測定艾瑞昔布代謝后形成羥化產(chǎn)物M1,檢測結(jié)果見圖2和圖3。 Figure 2Full scan MS 2s pectra of m /z 386(M1 Figure 3Chr omat ogra m s of i m recoxib (A ,M1(B and BAP910(C,internal standard,I S by selected reacti on monit oring (SR M scan moder CYP2C9和r CYP2D6對艾瑞昔布羥基化代謝能力的測定見圖4。艾瑞昔布被r CYP2C9代謝成羥化產(chǎn)物M1的速率為01585pmol m in -1(pmol r

16、 CYP -1,被r CYP2D6代謝成M1的速率為11894pmol m in -1(pmolr CYP -1。艾瑞昔布和r CYP3A4在相同條件下孵育,檢測計算M1的形成速率為01136pmol m in -1(pmol r CYP -1(圖略。艾瑞昔布和r CYP2C19在相同條件下孵育60m in,沒有檢測到M1形成。3主要代謝酶動力學(xué)參數(shù)由于艾瑞昔布在孵育體系中的溶解上限為40mol L -1,無法通過繼續(xù)增大其濃度來獲得更多的數(shù)據(jù)。所測得的數(shù)據(jù)利用Eadie 2Hofstee p l ots 法進行處理(表2。Table 2Enzy m e k i n eti cs param

17、eters of rCY P2C9and rCY P2D 6r CYP K m /mol L -1V max /pmol m in -1(pmol r CYP -12C9613341682D613164101124驗證酶濃度與酶促反應(yīng)速率成線性對r CYP2C9,r CYP2D6和r CYP3A4進行的酶濃度2反應(yīng)速率線性考察,表明這3種酶在5-80n mol L -1,酶濃度與反應(yīng)速率成線性關(guān)系,r CYP2C9酶濃度與反應(yīng)速率見圖5,r CYP2D6和r CYP3A4數(shù)據(jù)未列出。Figure 5Reacti on vel ocities linear with r CYP2C9concen

18、tration A:I ncubati on at 37with 50nmol L -1r CYP2C9and 5mol L -1i m recoxib;B:I ncubati on at 37with 50nmol L -1r CYP2D6and 5mol L -1i m recoxibFigure 4Ti m e course of M1p r oducti on incubated with r CYP2C9and r CYP2D6,separately5TNR法評估各rCY P酶作用大小在本文所采用的重組酶體系中,發(fā)現(xiàn)r CYP2C9, r CYP2D6和r CYP3A4可代謝艾瑞昔布

19、,利用T NR 法對其各自作用大小進行評估,結(jié)果見表3。Table3For ma ti on of M1by recom b i n an t CY P prote i n sr CYPM1f or mati onrate a/pmolm in-1(pmolr CYP-1Mean s pecificCYP content b/pmol(mgp r otein-1Nor malized M1for mati on rate/pmolm in-1(mg p r otein-1Percentageof t otalactivity/%2C901585965611662152D611894101819

20、421113A401136108141691614 a:I ncubati on at37with50n molL-1r CYP and5molL-1i m recoxib;b:M ean s pecific content of CYP in native hu man liver m icr os omes5T NR法為一種利用重組CYP酶評估各種CYP 亞型對藥物代謝程度大小的方法5,其公式如下:%T NR=pmol/m in/pmol r CYPnpmol mCYPn/mg(pmol/m in/pmol r CYPnpmol mCYPn/mg100討論藥物消除主要以代謝物或以原形物形式

21、排出體外,若主要以代謝物形式進行,則代謝情況會很大程度上影響藥物的使用安全性及藥理作用。藥物代謝中,肝臟中的CYP450酶系對藥物的氧化代謝占據(jù)主要位置。而某些CYP亞型(如CYP2D6, CYP2C19在人群中呈多態(tài)分布,有顯著的個體及種族差異,用藥時應(yīng)考慮到這些差異。采用個體化用藥能更好地發(fā)揮藥物的作用,減少不良反應(yīng)。某些CYP酶(如CYP2C9可被相應(yīng)藥物誘導(dǎo)或抑制,不恰當(dāng)?shù)穆?lián)合給藥將導(dǎo)致藥物相互作用,引起藥物藥理活性和安全性的改變,例如當(dāng)臨床治療中藥物達(dá)穩(wěn)態(tài)后聯(lián)合使用CYP450誘導(dǎo)劑或抑制劑,則往往需要調(diào)整藥物的劑量,以求獲得最好的臨床效果6。因此對藥物的CYP代謝酶的確證對于預(yù)測藥

22、物之間的相互作用及個體化用藥都十分重要。進行藥物代謝體外研究主要包括亞細(xì)胞水平和細(xì)胞水平,目前以亞細(xì)胞水平研究為主,通常利用肝微粒體進行,但人肝微粒體難以獲得,且受捐獻(xiàn)者生理或病理情況影響。近年來,隨著基因工程重組人源CYP純酶的商品化,利用重組CYP進行體外藥物代謝研究已成為藥物代謝研究的一個重要方面,并逐漸發(fā)展成為一種常規(guī)方法。利用T NR法評估藥物被CYP各亞型代謝程度,所得結(jié)果同抑制實驗、相關(guān)性實驗結(jié)果具有較好的一致性。但由于重組酶與真實的CYP存在一定差別,主要表現(xiàn)在蛋白環(huán)境,與NADPH2還原酶的比例不盡相同,其實驗結(jié)果可能與人體生理真實情況有所差異,但仍不失為一種準(zhǔn)確、快速確定藥

23、物CYP代謝亞型的方法4,5。本文通過體外人源重組CYP酶法確定了艾瑞昔布羥基化代謝酶為CYP2C9,CYP2D6,CYP3A4。在本文實驗條件下利用T NR法對其各自作用大小做出評估,由結(jié)果可以看出艾瑞昔布經(jīng)過多種CYP 亞型代謝,并以CYP2C9為主。同時使用CYP2C9底物或可誘導(dǎo)或抑制CYP2C9的藥物(如利福平或磺胺苯吡唑時可能會對艾瑞昔布藥效產(chǎn)生一定影響5;艾瑞昔布在人體內(nèi)代謝迅速,也可能是在肝中被多種CYP亞型廣泛代謝及在腸道中被CYP3A4代謝所致。References1Bai AP,Guo Z R,Hu WH,et al.Design,synthesis andin vitro evaluati on of a new class of novel cycl ooxygenase22inhibit ors:3,42diaryl232pyrr olin222onesJ.ChinChe m L ett,2001,12(9:775-778.2Slaughter D,Takenaga N,Lu P,et al.Metabolis m ofr ofecoxib in vitro using hu man liver subcellular fracti onsJ.D rug M etab D i