蟾酥對可移植性小鼠淋巴細胞白血病療效的研究

1、蟾酥對可移植性小鼠淋巴細胞白血病療效的研究              作者：朱大誠 尹小明 陳秀珍 羅小泉【摘要】  目的探討蟾酥對L615白血病的療效及其可能機制，并對其臨床應用提供參考。方法對小鼠行L615白血病造模。造模成功后，蟾酥溶液分別按低、中、高劑量進行腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)10 d，觀測小鼠體重變化，生存時間，外周血白細胞計數(shù)、分類及血小板計數(shù)，肝脾指數(shù)，肝、脾、骨髓涂片及骨髓白細胞分類，流式細胞術測定細胞凋亡率。結果 L615模型組體重明顯減輕

2、，蟾酥低、中、高劑量組體重無明顯變化；蟾酥低、中、高劑量組小鼠生存時間比L615模型組長，且中、高劑量具有顯著差異（P0.05或P0.01）；外周血象，同組不同病程，白細胞、血小板計數(shù)與實驗前比較有顯著差異（P0.05或P0.01）,瀕死期各組與L615模型組比較，白細胞、血小板計數(shù)，L615白血病細胞百分比有顯著差異（P0.05或P0.01）；白血病死亡小鼠蟾酥各組脾臟指數(shù)均低于L615模型組，且有差異（P0.05）；流式細胞術證實，蟾酥能誘導L615白血病細胞凋亡，凋亡率呈劑量依賴性。結論蟾酥對L615白血病具有一定的療效，其機制之一是誘導白血病細胞凋亡，其次蟾酥能抑制L615白血病細胞對

3、免疫系統(tǒng)的浸潤。 【關鍵詞】  蟾酥 L615白血病模型 生存時間 細胞凋亡 流式細胞術Abstract:ObjectiveTo study the therapeutic effects and the potential mechanism of Chansu on the L615 leukemia and provide some advice to its clinical practice. MethodsAfter the model was estabished successfully, Chansu solution (respectively by the lo

4、w, middle, high dose once a day) was injected intraperitoneally for 10 days continually, the body weight, survival time, peripheral blood leukocyte count and classification, platelet count, hepatosplenic index, hepatic and splenic and bone marrow smears, bone marrow leukocyte classification were obs

5、erved and the apoptosis rates were determined by FCM. ResultsThe weight in L615 group decreased obviously and the groups injected with Chansu had few changes; the survival time of Chansu groups were longer than those of L615 group, and there were significant differences between middle and high dose

6、Chansu groups(P0.05 or P0.01); peripheral hemogram, different illness time within the same group, leukocyte count and platelet count changed a lot after the experiment ( P0.05 or P0.01); during the dying period, compared with the L615 group, the leukocyte and platelet count and the L615 leukemia cel

7、l percentage had differences ( P0.05 or P0.01);significant differences was observed  between the splenic index of death leukemia mice and those in L615 group (P0.05); the FCM proved that Chansu could induce the apoptosis of L615 leukemia cells in dose-dependent manner. ConclusionChansu has some

8、 therapeutic effects to the L615 leukemia. To induce apoptosis is one of its mechanisms. Also, Chansu can inhibit the infiltration of leukemia cells to immune system.Key words:Chansu；  L615 leukemia mould；  Survival time；  Apoptosis；  FCM   以往的實驗結果表明，蟾酥對淋巴細胞白血病CEM細胞具有較強

9、的抑制作用，誘導CEM細胞調亡是其機制之一1。本研究進行體內實驗，利用蟾酥溶液作用于可移植性小鼠淋巴細胞白血病-L615白血病，觀察其療效?，F(xiàn)報道如下。1  材料和方法1.1  藥品 蟾酥購于山東臨沂愛康藥業(yè)有限公司，按文獻1配成濃度為10 mg/ml的蟾酥溶液，濾過除菌，然后再配成0.05，0.1 mg/ml和0.3 mg/ml 3種溶度備用。1.2  細胞培養(yǎng) L615白血病細胞株購于中國醫(yī)學科學院血液研究所（天津）。培養(yǎng)基為含體積分數(shù)10%的小牛血清（杭州四季青）的RPMI-1640（Gibco公司產品），并加入雙抗（青霉素100 g/m

10、l和鏈霉素100 g/ml）。在37，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱（Therno Forma公司產品）中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行造模。13   模型的建立 取對數(shù)生長期L615白血病細胞（L615細胞），離心1 500 r/min，8 min，去上清液，用生理鹽水洗滌2次，調整細胞終濃度為1.4×106/ml。取615近交系小鼠（購自中國醫(yī)學科學院血液學研究所）16只，鼠齡810周，體重2427 g，雌雄各半。無菌操作，每只小鼠腹腔注射接種L615細胞7×105個，造成L615白血病模型（全身白血?。?。小鼠在層流架內飼養(yǎng)，一切與鼠接觸的物品

11、均按無菌要求處理。1.4  分組及給藥方法 將L615白血病模型小鼠隨機分為4組。每組雌雄各半，即L615模型組（對照組）(模型組，每次給生理鹽水0.4 ml) ；蟾酥組（低劑量組，每次按0.6 mg/kg給藥），蟾酥組（中劑量組，每次按1.8 mg/kg給藥），蟾酥組（高劑量組，每次按5.4 mg/kg給藥）。模型建立后，第2天開始按以上方案腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)10 d。1.5  觀測指標體重變化；生存時間，用公式（T-C）/C×100%計算其生命延長率（T、C分別為試驗組、對照組平均生存天數(shù)）；外周血白細胞（WBC）計數(shù)及分類，血小板（PLT

12、）計數(shù)；肝脾指數(shù)；肝、脾、骨髓涂片及骨髓白細胞分類。         16   流式細胞術（FCM）分析  取瀕死期各組小鼠外周血，每個樣本0.5ml入已加淋巴細胞分離液的試管內，離心1 500 r/min，20min，然后小心吸出白色層（白細胞層），進行細胞計數(shù)（每個樣本細胞數(shù)應大于1×106），用PBS洗滌，然后按凱基Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產品）要求進行操作。上機檢測（流式儀為BECTON DICKNSON,B、D公司

13、產品），采用CenQuest軟件獲取10 000個細胞，ModFitlt軟件分析并獲得結果。1.7  統(tǒng)計學處理 采用雙側t檢驗，P0.05認為差異有顯著性。2  結果2.1   體重變化蟾酥，組給藥前，給藥后第5天及瀕死期小鼠體重無明顯改變，但對照組瀕死期與給藥前比較，體重有所減輕，且具有顯著性差異（P0.05）。結果見表1。表1  各組小鼠體重的變化比較 (略)2.2  生存時間 蟾酥，組與對照組比較，生存時間均有不同程度的延長，蟾酥，組比較差異具有顯著意義，各組小鼠生存時間及生命延長率結果見表2。表2

14、0;  各組小鼠生存時間比較(略)2.3  外周血象 L615白血病鼠分組給藥后，同組間比較白細胞數(shù)均逐漸上升，至第5天蟾酥、組有統(tǒng)計學意義。瀕死小鼠白細胞均顯著增高（P0.01）。血小板是先升后降，至瀕死期，各組血小板數(shù)已極度降低（P0.01）。在給藥后第5天外周血未發(fā)現(xiàn)L615細胞，但進入瀕死期對照組L615細胞已占50.25%，蟾酥，組L615細胞不及對照組高，并具有顯著性差異（P0.05,P0.01）。結果見表3。表3  各組小鼠外周血WBC，PLT計數(shù)及L615細胞百分比比較(略)2.4  肝脾指數(shù) 各組死亡小鼠的肝臟指數(shù)無

15、差異，脾臟指數(shù)蟾酥組較對照組低，組間比較有統(tǒng)計學意義（P0.05）。結果見表4。表4  各組肝脾指數(shù)比較(略)2.5  肝、脾、骨髓涂片及骨髓白細胞分類 對照組及蟾酥各組小鼠死亡后，取其肝、脾、骨髓進行涂片（解剖時見胸腹部皮下有出血點且對照組出血點更廣泛而密集，甚至出現(xiàn)淤斑），瑞氏染色。油鏡下可見，各組肝、脾、骨髓內絕大部分為L615細胞，且生長旺盛，尤其是肝臟內L615細胞比在體外培養(yǎng)時體積大，形狀不規(guī)則?？傮w印象：胞漿少，嗜堿性，核漿比例嚴重失調，胞核體積遠遠大于胞漿；核染色質粗，核仁1數(shù)個（圖1）。骨髓白細胞分類見表5。蟾酥組L615細胞百分比比對照組顯著減

16、少（P0.05）。表5  各組骨髓WBC及L615細胞百分比比較(略)2.6   流式細胞儀測定白細胞凋亡率 根據(jù)FCM檢測結果可知（圖2），蟾酥誘導L615白血病小鼠白細胞凋亡，隨藥物濃度的增加凋亡率也增加（圖2中右上象限為晚期凋亡百分率，右下象限為早期凋亡百分率，兩者之和為凋亡細胞百分率）。結果見表6。表6  各組白細胞凋亡率比較（略）3  討論   本實驗結果顯示：蟾酥作用于L615白血病小鼠后，能顯著延長小鼠生命，且隨藥物濃度增加，而生命延長率也增加，實驗前后，蟾酥組小鼠體重變化不大。而L615模型組體重明

17、顯減輕。外周血象瀕死期比較白細胞數(shù)，蟾酥組遠低于對照組；各組在病程早、中期血小板數(shù)量逐漸升高，進入白血病晚期隨之下降，對照組下降更為顯著，這與解剖所見對照組皮下出血點更明顯相一致。這可能是蟾酥對骨髓的異常造血功能具有抑制作用，而對凝血功能影響較小。L615細胞在外周血白細胞中所占比例對照組遠高于蟾酥各組。這些變化皆說明對照組小鼠的病情比蟾酥組更嚴重，從脾臟指數(shù)的變化顯示對照組脾臟受到了L615細胞的嚴重浸潤，同時說明蟾酥對L615細胞侵犯免疫系統(tǒng)具有一定的抑制作用。流式細胞術證實，蟾酥能誘導小鼠體內白血病細胞的凋亡。以上實驗數(shù)據(jù)表明，蟾酥對L615白血病具有一定的療效，其機制之一是誘導白細胞凋

18、亡，再則對機體免疫系統(tǒng)功能的保護有一定的作用。   目前白血病治療主要采用藥物、化療和骨髓移植等3個方面。藥物治療白血病效果不甚理想，副作用多，甚至出現(xiàn)骨髓抑制現(xiàn)象，化療雖有殺滅白血病細胞解除白血病細胞的浸潤作用，但同時對正常細胞也有損傷，骨髓移植成功率不高，且費用貴。根據(jù)白血病的臨床特點，在中醫(yī)學中屬于“急勞”“熱勞”“虛勞”“血癥”的范疇3。白血病屬頑疾，古代醫(yī)家認為對頑病痼疾當“以毒攻毒”，蟾酥為有毒中藥，以蟾酥治療白血病符合“以毒攻毒”原則。蟾蜍治愈淋巴細胞白血病就是個例子4。從蟾酥抗實體腫瘤顯示，它在抗腫瘤的同時還具有恢復細胞免疫功能及提升白細胞作用5。這與我們的實驗結果相一致，為蟾酥走向臨床，應用于白血病的治療提供了一定的理論依據(jù)。當前抗