脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗糖丸(猴腎細(xì)胞)

1、脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗糖丸（猴腎細(xì)胞）Jisuihuizhiyan Jiandu Huo Yimiao Tangwan (Houshen Xibao) Poliomyelitis Vaccine in Dragee Candy (Monkey Kidney Cell), live本品系用脊髓灰質(zhì)炎病毒、III型減毒株分別接種于原代猴腎細(xì)胞, 經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液后制成糖丸，用于預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎。1 基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原材料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合“凡例”要求；2 制造2.1 生產(chǎn)用細(xì)胞生產(chǎn)用細(xì)胞為原代猴腎細(xì)胞。2.1.1 細(xì)胞管理及檢定應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)和檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定

2、規(guī)程”規(guī)定。生產(chǎn)用猴腎細(xì)胞應(yīng)選自用未作過其他試驗(yàn)或做過本疫苗檢定的健康獼猴，所用動(dòng)物須經(jīng)不少于6周的隔離檢疫，應(yīng)無結(jié)核、B病毒感染及其他急性傳染病，血清中泡沫病毒（foamy）抗體應(yīng)為陰性。凡有嚴(yán)重化膿灶、贅生物以及明顯的肝、腎病理改變者不得使用。2.1.2細(xì)胞制備取符合2.1.1項(xiàng)要求的健康獼猴腎臟，經(jīng)胰蛋白酶消化、分散細(xì)胞，置37.0±0.5培養(yǎng)69天長(zhǎng)成單層。每只猴制備的細(xì)胞為1個(gè)細(xì)胞消化批，同一天制備的多個(gè)細(xì)胞消化批為1個(gè)細(xì)胞批。2.2 毒種2.2.1 名稱及來源生產(chǎn)用毒種為脊髓灰質(zhì)炎病毒I、II、III型減毒株，可用I、II、III型Sabin株、Sabin純化株、中2株病

3、毒或經(jīng)批準(zhǔn)的其他毒株。 2.2.2種子批的建立 應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)和檢定菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定。2.2.2.1原始種子批 Sabin株原始毒種、型及中2株均由毒種研制單位制備和保存。2.2.2.2主種子批 除WHO贈(zèng)送的Sabin株外，其他經(jīng)批準(zhǔn)的毒種由原始毒種在胎猴腎細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞上傳12代制成的成分均一的一批病毒懸液稱為主種子批。Sabin株主種子批的傳代水平為SO+1； 中2株主種子批傳代水平為中III2 1代；型pfizer株主種子批為RSO1。2.2.2.3工作種子批 主種子批毒種在原代胎猴腎細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞上傳l代制備成的成分均一的一批病毒懸液稱為工作種子批。2.2.3毒種傳

4、代從原始種子批到生產(chǎn)種子批的傳代次數(shù)，Sabin、型和其他純化株以及中2株不得超過3代；Sabin型及其他純化株包括pfizer株不得超過2代。制備生產(chǎn)用種子批所用的細(xì)胞應(yīng)限于原代胎猴腎細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞。2. 2 .4種子批的檢定除另有規(guī)定外，主種子批及工作種子批應(yīng)進(jìn)行以下全面檢定2.2.4.1 鑒別試驗(yàn)取適量型、型或III型單價(jià)脊髓灰質(zhì)炎病毒抗血清與適量病毒供試品混合，置3537中和12小時(shí)，接種猴腎細(xì)胞、Hep-2細(xì)胞或其他敏感細(xì)胞，置適宜溫度(3536)培養(yǎng)，7天判定結(jié)果，病毒型別應(yīng)準(zhǔn)確無誤。同時(shí)設(shè)血清和細(xì)胞對(duì)照，均應(yīng)為陰性。病毒對(duì)照應(yīng)為陽(yáng)性。2.2.4.2 病毒滴定采用微量細(xì)胞病變法

5、。取毒種作10倍系列稀釋，每稀釋度病毒液接種猴腎細(xì)胞、Hep-2細(xì)胞或其他敏感細(xì)胞，置適宜溫度（3536）培養(yǎng)，7天判定結(jié)果。病毒滴度均應(yīng)不低于 6.5Lg CCID50ml。應(yīng)同時(shí)進(jìn)行病毒參考品滴定。2.2.4.3 無菌檢查 依法檢查（附錄XII A）， 應(yīng)符合規(guī)定。2.2.4.4 支原體檢查依法檢查（附錄XII B）， 應(yīng)符合規(guī)定。2.2.4.5 病毒外源因子檢查依法檢查（附錄XII C）， 應(yīng)符合規(guī)定。2.2.4.6家兔檢查 毒種液應(yīng)進(jìn)行此項(xiàng)檢查，如不立即進(jìn)行試驗(yàn)，毒種液應(yīng)保存于-20以下。取體重為1.52.5kg的健康家兔至少5只，每只注射10ml，用其中1.0ml皮內(nèi)多處注射，其余皮

6、下注射，觀察3周。到期存活動(dòng)物數(shù)應(yīng)不低于80，無B病毒和其他病毒感染判為合格。家兔在24小時(shí)以后死亡，疑有B病毒感染者應(yīng)尸檢，須留神經(jīng)組織和臟器標(biāo)本待查，用腦組織作10懸液，用同樣方法接種5只健康家兔進(jìn)行檢查。2.2.4.7 免疫原性檢查用主種子批毒種制成疫苗，按常規(guī)接種易感兒童（免前抗體效價(jià)1:4） 至少30名，分別于免疫前及免疫后4周采血，測(cè)定中和抗體，免疫后抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率應(yīng)不低于95。2.2.4.8 猴體神經(jīng)毒力試驗(yàn)依法檢查（附錄 XI L）， 應(yīng)符合規(guī)定。2.2.4.9 rct特征試驗(yàn)將單價(jià)病毒液分別于36±0.1及40±0.1進(jìn)行病毒滴定，試驗(yàn)設(shè)t-對(duì)照（生產(chǎn)毒種或已

7、知對(duì)人安全的疫苗）。如果病毒液和t-對(duì)照在36±0.1的病毒滴度與40±0.1的滴度差不低于5.0 Lg，則 rct特征試驗(yàn)合格。2.2.4.10 SV40核酸序列檢查依法檢查（附錄IX H）， 應(yīng)為陰性。2.2.5 毒種保存液體毒種需加終濃度為1mol/L的氯化鎂溶液，置-60以下保存。2.3 原液2.3.1 細(xì)胞制備同2.1.2項(xiàng)。2.3.2 培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)液為含適量滅能新生牛血清的乳蛋白水解物Earles液或其他適宜培養(yǎng)液。新生牛血清的質(zhì)量應(yīng)符合要求（附錄XIII D）。維持液為不含新生牛血清的乳蛋白水解物Earles液或其他適宜的維持液。2.3.3對(duì)照細(xì)胞病毒外源因

8、子檢查依法檢查（附錄XII C）， 應(yīng)符合規(guī)定。2.3.4 病毒接種和培養(yǎng)毒種與細(xì)胞0.030.3MOI接種（同一工作種子批應(yīng)按同一MOI接種）， 種毒后置33±0.5培養(yǎng)4896小時(shí)至細(xì)胞出現(xiàn)完全病變后收獲。2.3.5 病毒收獲同一細(xì)胞消化批收獲的病毒液檢定合格后， 經(jīng)澄清過濾合并為單一病毒收獲液。2.3.6單一病毒收獲液檢定按3.1項(xiàng)進(jìn)行。2.3.7單一病毒收獲液保存2-8保存不超過30天，于-20保存不超過6個(gè)月。2.3.8合并或濃縮同一細(xì)胞批制備的多個(gè)單一病毒收獲液檢定合格后可適當(dāng)濃縮進(jìn)行合并， 經(jīng)澄清過濾即為單價(jià)原液。2.3.9 單價(jià)原液檢定按3.2項(xiàng)進(jìn)行。2.3.10 單

9、價(jià)原液保存2-8保存不超過30天。 于-20保存不超過6個(gè)月。2.4 半成品2.4.1 配制單價(jià)病毒原液加入氯化鎂，終濃度為1mol/L，經(jīng)除菌過濾后即為單價(jià)半成品。取適量I、II、III型單價(jià)半成品，按一定比例進(jìn)行配制，經(jīng)除菌過濾后即為三價(jià)疫苗半成品。2.4.2 半成品檢定按3.3項(xiàng)進(jìn)行。2.5成品2.5.1疫苗糖丸制備三價(jià)疫苗半成品及賦形劑按一定比例混合后制成糖丸。賦形劑成分包括50%還原糖漿、80%糖漿、 脂肪性混合糖粉和單糖粉。滾制糖丸時(shí)，操作室內(nèi)溫度應(yīng)在18以下。2.5.2 分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。同一次混合的三價(jià)疫苗半成品制備的糖丸為一批，非同容器滾制的糖丸分為不同亞批

10、。2.5.3 分裝應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。2.5.4規(guī)格每粒1g。每次人用劑量為1粒，含脊髓灰質(zhì)炎活病毒總量應(yīng)不低于5.95 LgCCID50，其中型應(yīng)不低于5.8 LgCCID50、型應(yīng)不低于4.8 LgCCID50、型應(yīng)不低于5.3 LgCCID50。2.5.5包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3 檢定3.1單一病毒收獲物檢定3.1.1 病毒滴定 按2.2.4.2 項(xiàng)，病毒滴度應(yīng)不低于 6.5 Lg CCID50ml。3.1.2 無菌檢查依法檢查（附錄XII A ）， 應(yīng)符合規(guī)定。3.1.3 支原體檢查依法檢查（附錄XII B）， 應(yīng)符合規(guī)定。3.2單價(jià)原液檢定3.2.1鑒

11、別試驗(yàn)按2.2.4.1項(xiàng)進(jìn)行3.2.2病毒滴定 按2.2.4.2 項(xiàng)進(jìn)行。病毒滴度均應(yīng)不低于 6.5 Lg CCID50ml。3.2.3無菌檢查依法檢查（附錄XII A ）， 應(yīng)符合規(guī)定。3.2.4 支原體檢查依法檢查（附錄XII B）， 應(yīng)符合規(guī)定。3.2.5 猴體神經(jīng)毒力試驗(yàn)依法檢查（附錄XI L）， 應(yīng)符合規(guī)定。3.2.6. SV40核酸序列檢查依法檢查（附錄IX H）， 結(jié)果應(yīng)為陰性。3.3 半成品檢定3.3.1病毒滴定按2.2.4.2項(xiàng)進(jìn)行。單價(jià)疫苗半成品病毒滴度應(yīng)不低于 6.5Lg CCID50ml。三價(jià)疫苗半成品病毒滴度應(yīng)不低于7.15 Lg CCID50ml，其中I型應(yīng)不低于7

12、.0 Lg CCID50ml ，II型應(yīng)不低于6.0 Lg CCID50ml，III型應(yīng)不低于6.5 Lg CCID50ml。3.3.2無菌檢查 依法檢查（附錄XII A）， 應(yīng)符合規(guī)定。3.4 成品檢定每個(gè)糖丸滾制容器取200300粒。3.4.1 鑒別試驗(yàn)取適量、III型三價(jià)混合脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫血清與適量供試品混合，置3537中和12小時(shí)，接種Hep-2細(xì)胞或其他敏感細(xì)胞，置適宜溫度(3536)下培養(yǎng)，7天判定結(jié)果，應(yīng)無病變出現(xiàn)。同時(shí)設(shè)血清和細(xì)胞對(duì)照，均應(yīng)為陰性。病毒對(duì)照應(yīng)為陽(yáng)性。3.4.2 外觀應(yīng)為白色固體糖丸。3.4.3 丸重差異取糖丸20粒測(cè)定，重量為1g±0.15g /粒

13、。3.4.4.病毒滴定每3-4亞批合并為1個(gè)檢定批，取100粒糖丸，加Earle氏液至1000ml，即為l:10稀釋度采用細(xì)胞病變法進(jìn)行病毒滴定。三價(jià)疫苗糖丸以混合法測(cè)定病毒含量，同時(shí)應(yīng)以中和法檢測(cè)各型病毒含量。采用中和法需預(yù)先精確測(cè)定異型抗體的交叉抑制值，以校正滴定結(jié)果。按2.2.4.2項(xiàng)測(cè)定病毒滴度，每劑三價(jià)疫苗糖丸總病總量應(yīng)不低于5.95 LgCCID50，其中型應(yīng)不低于5.8 LgCCID50，型應(yīng)不低于4.8 LgCCID50，型應(yīng)不低于5.3 LgCCID50。3.4.5 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)疫苗出廠前應(yīng)進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)， 應(yīng)與病毒滴定同時(shí)進(jìn)行。37放置48小時(shí)后，按2.2.4.2 項(xiàng)進(jìn)行

14、病毒滴定，每劑量病毒滴度應(yīng)不低于5.0 LgCCID50，病毒滴度下降應(yīng)不高于1.0 Lg。3.4.6病毒分布均勻度 每批抽查糖丸10顆以上， 測(cè)定疫苗糖丸的病毒分布均勻度。逐顆滴定病毒含量，各顆之間的病毒差不得超過0.5 Lg。3.4.7 微生物限度檢查同天滾制的糖丸為1個(gè)供試品，每個(gè)糖丸滾制容器取樣不得少于10粒，每粒雜菌數(shù)不得超過300個(gè)（附錄XII G）。3.4.8 致病菌檢查不得含有乙型溶血性鏈球菌、腸道致病菌以及大腸桿菌。3.4.8.1 乙型溶血性鏈球菌檢查取10倍稀釋疫苗0.5ml接種肉湯1支，37培養(yǎng)24小時(shí)，再用劃線法移種血平皿1個(gè)，37培養(yǎng)24小時(shí)，應(yīng)無乙型溶血性鏈球菌生長(zhǎng)（如原料、輔料已作過此項(xiàng)檢查并合格，成品可不再作）。3.4.8.2 腸道致病菌檢查取10倍稀釋供試品1.0ml接種GN或肉湯增菌培養(yǎng)基1管，37培養(yǎng)，于624小時(shí)內(nèi)用劃線法轉(zhuǎn)種鑒別培養(yǎng)基平皿