艾炷灸對(duì)D-半乳糖衰老小鼠大腦組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響

1、艾炷灸對(duì)D-半乳糖衰老小鼠大腦組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響                     作者：趙利華，韋良玉，王進(jìn)聲，姚平，陳煌【摘要】  目的觀察艾炷灸對(duì)腦組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響。方法將健康3月齡昆明雄性小鼠按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為：造模組、生理組、艾灸1組、艾灸2組、電針組、尼莫地平組6組，每組各12只。另設(shè)自然衰老組（16月齡）昆明雄性小鼠12只。造模組、艾灸1，2組、電針組、

2、尼莫地平組，連續(xù)42 d頸背部皮下注射D半乳糖造成小鼠衰老模型；生理鹽水組連續(xù)42 d頸背部皮下注射等量生理鹽水，12 d后艾灸1，2組，分別選取小鼠“足三里、懸鐘”，“關(guān)元、百會(huì)”行艾柱灸治療，電針組取“足三里、懸鐘”治療，尼莫地平組給予尼莫地平灌胃，均為隔日1次，共15次。采用光鏡觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化和神經(jīng)元密度，電鏡下觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果生理組大腦皮層、海馬CA3區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。模型組、自然衰老組可見(jiàn)皮層、海馬CA3區(qū)變薄，大部分神經(jīng)元變性，胞核與胞漿界限模糊，核固縮，核仁消失。艾灸1，2組、電針組和尼莫地平組仍有不同程度的神經(jīng)細(xì)胞變性，但變性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著減少。各組小鼠腦皮質(zhì)及海

3、馬CA3區(qū)神經(jīng)元密度差異有顯著性意義（P<0.01），模型組、自然衰老組與生理組、艾灸1，2組、電針組、尼莫地平組神經(jīng)元密度比較差異有顯著性意義（P<0.01），模型組、自然衰老組神經(jīng)元細(xì)胞密度下降。大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)，生理組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞漿較寬，細(xì)胞器豐富，核仁清楚。模型組和自衰組神經(jīng)元細(xì)胞變性，凋亡細(xì)胞器減少。其他各治療組超微結(jié)構(gòu)損傷較模型組和自衰組減輕。結(jié)論艾炷灸“足三里、懸鐘”，“關(guān)元、百會(huì)”可減輕D-半乳糖造成的氧化損傷，保護(hù)腦組織形態(tài)及其神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 【關(guān)鍵詞】  艾炷灸； D-半乳糖； 病理形態(tài)； 超微結(jié)構(gòu)  隨著年齡的增長(zhǎng)，大腦神經(jīng)細(xì)

4、胞數(shù)量減少，突起萎縮，大腦為首的中樞神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)健忘、反應(yīng)遲鈍、動(dòng)作不協(xié)調(diào)等腦萎縮癥狀，甚至喪失社會(huì)活動(dòng)能力、生活不能自理的老年癡呆的證候。祖國(guó)醫(yī)學(xué)稱為“髓海不足”。靈樞·海論早有明確記載：“髓海有余，則輕勁多力，自過(guò)其度”,“髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒，目無(wú)所見(jiàn)，懈怠安臥?！鼻宕舭旱谋静輦湟嗍觯骸叭酥浶跃谀X中，小兒善忘者，腦未滿也，老年健忘者，腦漸空也?！睔v代醫(yī)家都重視艾炷灸防治疾病，延年益壽，故有“保健灸”“長(zhǎng)壽灸”之說(shuō)。目前臨床研究證實(shí)針灸對(duì)腦萎縮、老年性癡呆等有較好的療效1，2。本文從大腦組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化探討艾炷灸延緩腦衰老的作用機(jī)制。1  材

5、料與儀器1.1  動(dòng)物健康3月齡昆明雄性小鼠。體質(zhì)量（30±2）g，80只。另購(gòu)置老年前期（16月齡）昆明雄性小鼠12只。均由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK桂2003-0003）。1.2  艾灸用品精制艾絨為蘇州東方艾絨廠提供。1.3  儀器和試劑奧林巴斯生物顯微攝影系統(tǒng)（BX60 PM20 型，日本）；全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)（HM355S 型，MICROM德國(guó)）；Matic Images Advanced 3.2病理圖文分析系統(tǒng)(Motic China Group Co.,Ltd.)；JEM100CX-II透射電鏡。D-半

6、乳糖為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；尼莫地平片為山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供；0.9%生理鹽水為廣西中醫(yī)學(xué)院一附院制劑室提供； 4%多聚甲醛、戊二醛（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；1%鋨酸、丙酮、環(huán)氧樹(shù)脂812+815、醋酸鈾、枸櫞酸鉛（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)系制備）。2  方法2.1  動(dòng)物分組用Morris水迷宮篩選游泳距離不低于2 600 cm/2 min、體質(zhì)量不低于28 g的72只健康雄性小鼠。按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將72只小鼠分為：造模組、生理組、艾灸1，2組、電針組、尼莫地平組6組，每組各12只。16月齡昆明雄性小鼠12只為自然衰老組（簡(jiǎn)稱自衰組）。2.2

7、0; 造模方法參照文獻(xiàn)3用D-半乳糖頸背部皮下注射，建立亞急性衰老小鼠模型。將D-半乳糖試劑與生理鹽水按1.2（g）：100（ml）混勻?yàn)椋?2 mg/ml），造模組、艾灸1，2組、電針組、尼莫地平組每天以D半乳糖按120 mg/kg/d頸背部皮下注射（相當(dāng)于每10 g體重注射0.1 ml濃度為1.2%的D半乳糖溶液），連續(xù)42 d，同時(shí)對(duì)生理組頸背部皮下注射等量的生理鹽水42 d。2.3  治療方法造模第13天開(kāi)始治療,艾灸1組選取小鼠“足三里、懸鐘”，艾灸2組選用“百會(huì)、關(guān)元”進(jìn)行艾柱灸治療，時(shí)間選擇上午9:0011:30，選取小鼠雙側(cè)“足三里”（先灸）、“懸鐘”（后灸），及“百

8、會(huì)”（先灸）、“關(guān)元”（后灸），灸后用棉簽輕輕按壓穴位。每次3壯/穴。定位取穴按照實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)4和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸手冊(cè)5，“足三里”在膝關(guān)節(jié)下方，腓骨小頭下3 mm處的肌溝中；“懸鐘”在后肢外踝尖直上5 mm腓骨后緣處,“百會(huì)”在頂骨正中處，“關(guān)元”臍下正中線1 cm處。穴位選定后剪毛，施灸時(shí)涂凡士林以保護(hù)小鼠皮膚且便于固定艾炷，艾炷做得緊而結(jié)實(shí)(底座直徑2 mm，高度5 mm,重量約1315 mg)，用線香點(diǎn)燃，每壯時(shí)間約1820 s，當(dāng)小鼠掙扎時(shí)更換艾炷。電針組將輸出電流正極接足三里，負(fù)極接懸鐘，用20Hz連續(xù)波，電流0.240.3 Am以小鼠肢體輕微抖動(dòng)，不嘶叫為度，3 min/次。尼莫地平灌

9、胃組劑量按體表面積等效折算計(jì)算法，予12 mg/(kg·d)，灌胃。治療方法均為隔天1次，共15次。生理組和造模組、自衰組不做任何治療性干預(yù)，但給予與各治療組同樣時(shí)間、同等程度的綁縛刺激。2.4  樣本制備將小鼠斷頭處死，于冰浴上取左側(cè)大腦額葉皮質(zhì)處組織23 mm3投入3%戊二醛固定3 h以上，送檢。剩余的于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。所有組織蠟塊4 m連續(xù)切片4張置60烤箱烤干。另取自衰組（相當(dāng)人60歲）6小鼠6只，斷頭處死，標(biāo)本處理同前述。2.5  指標(biāo)檢測(cè)HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化并攝片。采用Matic Images Advanced 3.2病理圖文系統(tǒng)分析，在顯微鏡下于每張病理切片皮層和海馬兩個(gè)部位，分別選取不相重疊的126個(gè)視野，計(jì)數(shù)完整的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)，其與視域參考面積(3 951.3161 975.66 m2)的比值(單位面積神經(jīng)元數(shù))即是神經(jīng)元密度。    電鏡下總體觀察大腦皮層神經(jīng)組織超微結(jié)構(gòu)變化：神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、髓鞘、軸索及血管病變。2.6  統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件包處理，各組完整大腦皮質(zhì)、海馬神經(jīng)元密度用±s,進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)的方差分析