微生物學(xué)實驗基本操作及培訓(xùn)

1、1、無菌概念： 什么地方是有菌的，什么地方是無菌的； 哪些地方要求基本無菌，哪些地方嚴(yán)格要求無菌。 2、操作環(huán)境： 實驗室；接種箱；超凈工作臺；無菌工作室。 3、工作范圍： 接種、轉(zhuǎn)管、倒平板、梯度稀釋、涂平板、平板劃線、菌體(菌懸液)轉(zhuǎn)移及其他需要無菌操作的實驗環(huán)節(jié)。 4、要領(lǐng)及注意事項： （以實驗室接種、轉(zhuǎn)管為例）（1）斜面、接種環(huán)拿法；（2）火焰保護(hù)；（3）接種環(huán)滅菌；（4）接種環(huán)冷卻及輕快接觸斜面；（5）棉塞的制作及處理。 1、類型：分裝片和涂片； 2、操作步驟：（以涂片為例） 1） 涂片：載玻片-滴加生理鹽水-挑菌涂成 薄膜； 2）干燥：室溫自然干燥： 3）固定：菌面向上，火焰上過2

2、-3次： 4）染色：滴加染色液（美藍(lán)）,覆蓋（2-3分 鐘）； 5）水洗：自來水沖洗，至基本無色，晾干； 6）鏡檢：調(diào)節(jié)光源，低倍鏡觀察，高倍鏡觀察， 油鏡觀察。4、要領(lǐng)及注意事項： （1）生理鹽水和菌體一定不能過多； （2）菌膜不能過厚，最好細(xì)胞分布疏密相間； （3）固定要到位，不能殘留水，也不能固定過度； （4）染色時間正確，一定要按規(guī)定計時； （5）水洗時，水流不宜過急； （6）鏡檢前片子一定要干燥無水。1工作范圍： 觀察細(xì)菌及相近大小的微生物，真核微生物的細(xì)胞器。2、使用特點： 一定要用油；操作要求較高。3、要領(lǐng)及注意事項： （1）所用裝片、涂片上一定不能有水； （2）先用低、高倍鏡觀

3、察并選好視野，并將待 觀察目標(biāo)調(diào)至視野正中心； （3）注意保護(hù)鏡頭和片子，從側(cè)面觀察鏡頭進(jìn) 入油系； （4）油鏡頭觀察時，用微調(diào)調(diào)焦距，始終按 鏡、片分離方向用微調(diào)調(diào)焦距； （5）調(diào)焦距速度一定要慢，避免焦躁,因為圖象 出現(xiàn)的焦距范圍很?。?（6）注意光線的強(qiáng)弱； （7）用擦鏡紙蘸取溶劑（二甲苯）擦凈鏡頭和裝 片。1工作范圍： 細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法之一，也可用于其他微生物的鑒別中。 一般的微生物形態(tài)觀察不必用革蘭氏染色。2、基本步驟： 1）初染：結(jié)晶紫染色； 2）媒染：碘液媒染； 3）脫色：乙醇脫色； 4）復(fù)染：番紅復(fù)染; 3、要領(lǐng)及注意事項： 1）菌種的菌齡，要選擇生長旺盛期的典型菌體

4、； 2）制片，按單染色的基本要求操作； 3）乙醇脫色時間是本實驗成功與否的關(guān)鍵，注意 襯以白背景，用95%乙醇滴洗至剛剛剛剛無紫色為 止，約2030秒，立即立即用水沖凈乙醇； 4）觀察時，以分散開的細(xì)菌顏色為準(zhǔn)。 5）對未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時，應(yīng)選擇兩株形態(tài) 不同、染色結(jié)果不同的已知菌和未知菌一起混合 制片、染色。（1）細(xì)菌、放線菌是原核生物，酵母菌和霉）細(xì)菌、放線菌是原核生物，酵母菌和霉 菌是真核生物，大小不同；菌是真核生物，大小不同；（2）放線菌和霉菌是絲狀菌，細(xì)菌和酵母菌）放線菌和霉菌是絲狀菌，細(xì)菌和酵母菌 是非絲狀菌；是非絲狀菌；（3）霉菌有孢子柄、子實體等特化形態(tài)，放）霉菌有孢子柄、

5、子實體等特化形態(tài)，放 線菌沒有。線菌沒有。（4）一定要注意提問，不要理解為菌落形）一定要注意提問，不要理解為菌落形 態(tài)。態(tài)。1工作范圍： 此法計得的是死、活菌的總數(shù)，故稱總菌計數(shù)法。2、基本步驟： 1）稀釋：將酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，菌液不濃，可不必 稀釋。 2）鏡檢計數(shù)室：在計數(shù)前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進(jìn)行鏡 檢。若有污物，則進(jìn)行清洗。 3）加樣品：蓋上蓋玻片，用毛細(xì)管將菌液由蓋玻片邊緣滴 一小滴，讓其自行滲進(jìn)計數(shù)室。不可有氣泡。 4）顯微鏡計數(shù)：五分鐘后，先低倍鏡找計數(shù)室，后高倍鏡 計數(shù)。一般以每小格510個菌體為宜。常選四角 和中央五個中格計數(shù)。格線上菌體只數(shù)上線和左 邊線。芽大于母體一半

6、方計。同法計另一室。5）清洗血球計數(shù)板：自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，自行 晾干。鏡檢，洗凈為止。3、要領(lǐng)及注意事項：（1）計數(shù)結(jié)果是微生物總數(shù)，含死、活菌；（2）菌懸液要搖勻；（3）計數(shù)格數(shù)和分布要合理；（4）對壓線、出芽等情況處理；（5）菌懸液稀釋要適當(dāng)，不要過濃或過??；（6）光線要適中（尤其不要太強(qiáng)），否則找不到計 數(shù)室；（7）要先低倍鏡，后高倍鏡。1工作范圍： 原核微生物的測定一般要用油鏡頭； 真核微生物的測定一般用高倍鏡即可； 測微尺多用來測定細(xì)菌和酵母菌，放線菌和霉菌較少。2、操作步驟 1）目鏡測微尺的標(biāo)定 (1)放置目鏡測微尺：測微尺刻度朝下； (2)放置鏡臺測微尺：測微尺刻度朝上

7、； (3)校正目鏡測微尺：按低、高、油順序，使兩種測微尺某一區(qū)間的 兩對刻度線完全重合，按下式計算： 兩對重合線間鏡臺測微尺格數(shù)10目鏡測微尺每小格長度（um）= 兩對重合線間目鏡測微尺格數(shù) 2）菌體大小的測定：換上裝片，測出菌體長寬格數(shù)，算出菌體大小。 3）取出目鏡測微尺，將兩種測微尺用擦鏡紙擦凈，入盒。 3、要領(lǐng)及注意事項：（1）鏡臺測微尺刻度務(wù)必朝上；（2）目鏡測微尺刻度朝下，放于目鏡與鏡頭之間；（3）按低、高、油順序校正目鏡測微尺；（4）兩對刻度線要整格完全重合；（5）鏡臺測微尺線條太粗時，可與線條的同邊對齊。（6）測細(xì)菌等原核微生物時，用油鏡頭要嚴(yán)格按油鏡頭的 使用要求操作，要特別注

8、意光線的強(qiáng)弱。（7）對不到一格的數(shù)值的判斷一定要盡量準(zhǔn)確，不能馬 虎；（8）對各類微生物的大小要心中有數(shù)，如計算的結(jié)果與理 論值差距很大，要驗算。 1工作范圍： 斜面：培養(yǎng)和保存菌種； 平板：微生物分離、純化和活菌計數(shù)； 搖瓶：微生物液體培養(yǎng)，模擬發(fā)酵罐。2、操作步驟： 1）按培養(yǎng)基配方稱量各種藥品、試劑； 2）斜面和平板按要求稱量瓊脂，搖瓶不用瓊脂； 3）溶化：加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，在電 熱套上加熱使其溶解。加入瓊脂，加熱，攪拌溶化， 補(bǔ)充水分至所需的總體積； 4）調(diào)pH：測pH值，用滴管向培養(yǎng)基中加入NaOH或 HCl,邊調(diào)邊測，直至要求的pH范圍； 5）分裝：將配制的培養(yǎng)基分

9、裝入試管和三角燒瓶（250ml） 內(nèi)，試管裝1/4。6）加塞：在管（瓶）口塞上棉塞，既保證通氣又可阻止外 界微生物進(jìn)入造成污染： 搖瓶用八層紗布蓋口；7）包扎8）滅菌9）擱置斜面：趁熱將試管棉塞端擱在玻棒上，使斜 面長度不超過試管長度的一半； 倒平板：用無菌操作的方法將三角燒瓶中的培養(yǎng)基趁熱 倒入培養(yǎng)皿中，6-7個/100 ml；10）無菌檢查：將斜面37恒溫培養(yǎng)2448小時，以檢查 滅菌是否徹底。3、要領(lǐng)及注意事項： 1）各種藥品、試劑的稱量要注意精確性； 2）微生物培養(yǎng)用培養(yǎng)基一般用自來水配制； 3）斜面的瓊脂溶化要徹底； 4）調(diào)pH（除“自然”外）千萬不要省略； 5）分裝培養(yǎng)基應(yīng)用培養(yǎng)基

10、分裝器（移液管、玻璃 漏斗）分裝，不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上； 6）倒平板時，注意避免燒、燙手。1、操作步驟： 1) 通電，打開開關(guān)，觀察指示燈，視狀態(tài)添加 水； 2) 放置滅菌物品； 3) 設(shè)定溫度、時間（121，20 min），通電加 熱； 4) 完全排凈冷空氣，關(guān)上排氣閥； 5) 滅菌結(jié)束后，切斷電源，使鍋內(nèi)溫度自然降至 壓力為0，打開排氣閥 6) 取出滅完菌的培養(yǎng)基、物品，自然冷卻，排盡 水。2、要領(lǐng)及注意事項： 1）一定要檢查水位； 2）溫度和時間設(shè)置方法按說明書要求操作； 3）排凈冷空氣是關(guān)鍵，要理解原理； 4）應(yīng)開蓋蒸發(fā)一定時間后再取出滅完菌的培 養(yǎng)基、物品； 5）大膽、細(xì)心，注意安全。1、試管：若干試管一捆，棉塞外包一層牛皮 紙；2、三角燒瓶：棉塞外包一層牛皮紙，以防冷 凝水潤濕棉塞，用繩子扎好；3、移液管：上口塞棉花