水楊梅根提取物的體外抗腫瘤活性

1、水楊梅根提取物的體外抗腫瘤活性                                      作者：葉勇 涂先琴 宋興文 施敏榮 江虹  【摘要】  目的分離篩選水楊梅根中抗直腸癌細(xì)胞活性部位。方法

2、采用系統(tǒng)溶劑法對(duì)水楊梅根水提取物進(jìn)行分離，應(yīng)用MTT比色法對(duì)分離得到的部位進(jìn)行體外抗腫瘤活性的測(cè)定。結(jié)果乙酸乙酯提取物對(duì)直腸癌LS174T細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好劑量依賴性抑制作用，而正丁醇和氯仿提取部位的抑制作用較弱。結(jié)論乙酸乙酯提取部位是水楊梅抗腫瘤主要的活性部位。 【關(guān)鍵詞】  MTT法 水楊梅根 直腸癌Abstract：Objective To screen the anticancer fraction from extract of root of Adina rubella Hance.MethodsTo separate the water

3、 extract from root of Adina rubella Hance by different solvens，then determine their anticancer activities of the different extracts in vitro with MTT method.ResultsThe ethylacetate extract strongly inhibited cell proliferation of LS174T,and showed significant dosagedependent response while the butan

4、ol extract and the chloroform extract showed low anticancer activities in vitro.ConclusionThe ethylacetate extract is the principal anticancer extract from root of Adina rubella HanceKey words：MTT；root of Adina rubella Hance；rectal cancer    中藥水楊梅根為茜草科落葉灌木植物水楊梅Adina rubella(Sieb.et Zu

5、cc.)Hance的根，分布于我國(guó)江南及華南一帶。臨床表明它有抗消化道腫瘤的作用1，雖有報(bào)道自水楊梅根中分離出數(shù)種新化合物2，但有關(guān)其抗腫瘤活性報(bào)道甚少。本文以水楊梅根為實(shí)驗(yàn)材料，將其提取物對(duì)人直腸癌LS174T細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察水楊梅根提取物對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用，為水楊梅提取物抗腫瘤作用成分及其機(jī)理的研究提供依據(jù)。1  實(shí)驗(yàn)材料11  藥材  水楊梅根購(gòu)自浙江臨安中藥飲片廠，批號(hào)：2004071012  細(xì)胞  人直腸癌LS174T細(xì)胞，廣東中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。在5CO2，37條件下，用含10小牛血清、青霉素(100gml)，鏈霉素(1

6、00gml)，RMPI1640培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。13  藥品與試劑  RPMI一1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；小牛血清為四季青公司產(chǎn)品；MTT和DMSO均為AMRESCO公司產(chǎn)品，其余試劑均為分析純。2  方法21  水楊梅有效成分提取與配制  干燥水楊梅根1kg，加入5000ml蒸餾水，90煎煮2h,過(guò)濾,濾渣再加3000ml蒸餾水繼續(xù)90煎煮2h,過(guò)濾，將兩次濾液合并后濃縮到1500ml。依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取。每次加入溶劑1/2體積萃取2次，各部分萃取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮并回收溶劑，濃縮液揮干溶劑

7、后稱重，計(jì)算得率。所得的各提取物分別用二華南理工大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（322-E5041170）；學(xué)生研究計(jì)劃SRP項(xiàng)目（B10-Y13014）甲基亞砜(DMSO)配成lgml，分裝于4保存，臨用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，并使各組所含DMSO終濃度0.1。22  MTT法  采用文獻(xiàn)方法3。直腸癌細(xì)胞以8×103個(gè)孔的接種量接種于96孔培養(yǎng)板，5CO2、37溫箱中培養(yǎng)24h后，每孔加入不同濃度的藥物各10L使初步篩選的藥物終濃度分別為103、102、10gml，繼續(xù)培養(yǎng)24h；而最終篩選的藥物濃度分別為200、400、600、800g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，

8、分別加入50L MTT溫育4h，棄去培養(yǎng)基，加入150L DMSO，在平板搖床上搖勻，在酶標(biāo)儀495nm讀板，根據(jù)測(cè)得的吸光度值按下式計(jì)算抑制率。按改良的Karber公式計(jì)算48h各提取部位的IC50值。抑制率=(1一實(shí)驗(yàn)組吸光度值對(duì)照組吸光度值)×10023  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  組問(wèn)比較和不同濃度條件下比較均采用齊性方差t檢驗(yàn)。                     

9、        3  結(jié)果31  不同溶劑提取率  系統(tǒng)溶劑法分離提取部位各提取部位稱重，計(jì)算得率(相對(duì)于總提物)，結(jié)果氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位的得率分別為0096%，026%和129%。32    各提取部位對(duì)人直腸癌LS174T細(xì)胞的增殖抑制作用24h水楊梅根對(duì)直腸癌細(xì)胞作用效果表明，在101000gml濃度范圍內(nèi)，乙酸乙酯提取部位對(duì)人直腸癌LS174T細(xì)胞的增殖具有抑制作用；而氯仿和正丁醇提取部位的抑癌作用活性很低。通過(guò)延長(zhǎng)各提取部位對(duì)人直腸癌LS

10、174T細(xì)胞的作用時(shí)問(wèn)及增加它們的實(shí)驗(yàn)濃度梯度，結(jié)果表明，不同濃度的各提取部位處理LS174T細(xì)胞，隨濃度增加其抑制率也增加，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)為劑量依賴性抑制。其中乙酸乙酯提取部位對(duì)人直腸癌LS174T細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，而氯仿和正丁醇部位的抑癌作用不明顯。結(jié)果見表1、2。表1  水楊梅根提取物對(duì)LS174T作用24小時(shí)后各組OD值和抑制率(略)與空白對(duì)照組相比，*P<001表2  水楊梅根提取物對(duì)LS174T作用48小時(shí)后各組OD值和抑制率(略)與空白對(duì)照組相比，*P<005，*P<00133  各提取部位對(duì)人直腸癌LS174T細(xì)

11、胞增殖抑制作用的比較  通過(guò)改良的Karber公式計(jì)算48h各提取部位的IC50值。乙酸乙酯提取部位的IC50為48357g/ml，而正丁醇、石油醚提取部位的IC50分別是89026g/ml和73033g/ml。比較各提取部位對(duì)人直腸癌LS174T細(xì)胞的IC50值，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取部位對(duì)人直腸癌LS174T細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)，正丁醇提取部位次之，氯仿提取部位抑癌作用則不明顯。由此提示水楊梅抗直腸癌LS174T細(xì)胞的有效部位可能在乙酸乙酯及正丁醇部位，其中乙酸乙酯提取物是最主要的活性部位。4  討論目前，直腸癌的主要治療手段是手術(shù)治療和化療。手術(shù)治療對(duì)病人帶來(lái)生活的不便和心理上的痛苦，化療又存在較強(qiáng)的毒副作用。因此尋找既有較好療效而又無(wú)明顯毒副作用的中藥，單獨(dú)使用或聯(lián)合化療以提高療效和減少毒副作用，是直腸癌防治的必然趨勢(shì)。臨床實(shí)驗(yàn)表明水楊梅根能抑制消化道腫瘤，為其成分研究提供了前提。本研究則揭示水楊梅根主要活性成分存在于乙酸乙酯提取物中，表明它可能是酚性化合物。因此下一步的研究將針對(duì)乙酸乙酯提取物作進(jìn)一步分離，從而探明水楊梅根的抗腫瘤成分?！緟⒖嘉?/p>