顏面贗復(fù)體粘接劑的體外細(xì)胞毒性

1、顏面贗復(fù)體粘接劑的體外細(xì)胞毒性         08-10-15 13:24:00     編輯：studa20              作者：康彪,馬佳,趙銥民,趙信義,楊青芳   【摘要】  目的： 利用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù), 對有機(jī)硅改性聚丙烯酸酯類顏面贗復(fù)體粘接劑1（FPSA1）的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價. 方法： 采用

2、MTT法評價FPSA1的細(xì)胞毒性. 利用體外培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細(xì)胞(L929),在培養(yǎng)液中分別添加500，750 mL/L FPSA1浸提液,于加樣后2，4，7 d用MTT法顯色, 用多道掃描酶標(biāo)儀測A490 nm值,計算相對增殖率,對FPSA1的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價. 結(jié)果： 隨著時間推移,不同濃度的FPSA1浸提液對L929細(xì)胞增殖均無明顯作用(P>0.05), 各濃度FPSA1浸提液加樣后2，4，7 d之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示L929細(xì)胞增殖與浸提液濃度無明顯相關(guān)性,FPSA1的細(xì)胞毒性分級為1級. 結(jié)論: FPSA1無明顯細(xì)胞毒性, 具有良好細(xì)胞相容性, 是一

3、種有發(fā)展前景的顏面贗復(fù)體粘接材料. 【關(guān)鍵詞】  顏面部缺損；贗復(fù)體粘接劑；細(xì)胞毒性；MTT法0引言顏面贗復(fù)體的固位中組織倒凹和機(jī)械固位多用作輔助方式,種植體固位雖然是顏面贗復(fù)體首選的固位方式1,但由于多種原因使患者不能接受種植手術(shù)時, 就需依賴粘接固位. 傳統(tǒng)的贗復(fù)體粘接劑中,聚丙烯酸酯類粘接劑價廉,粘接強(qiáng)度尚可,但皮膚上的粘接劑殘留較難去除2；有機(jī)硅類粘接劑粘接強(qiáng)度高,皮膚殘留少,但含有機(jī)溶劑具有潛在刺激性3. 我們通過乳液聚合的方法合成有機(jī)硅改性聚丙烯酸酯類的顏面贗復(fù)體粘接劑1（facial prosthesisskin adhesive1,FPSA1）,并參照國際標(biāo)準(zhǔn)化組織發(fā)

4、布的醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗4,將小鼠肺成纖維細(xì)胞(L929)在離體狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng),以探討FPSA1浸提液對L929細(xì)胞生物學(xué)活性的影響,評價其生物的相容性.1材料和方法1.1材料FPSA1 (第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院與西北工業(yè)大學(xué)聯(lián)合研制)；無菌濾紙, 高壓蒸汽滅菌后備用. L929細(xì)胞株（第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研室）；DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；含100 mL/L的標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS,杭州四季青公司)；100 kU/L氨芐青霉素、100 kU/L硫酸鏈霉素, pH=7.27.4；胰蛋白酶,四甲基偶氮唑鹽(MTT) (美國Sigma公司)；四甲基偶氮唑鹽溶液

5、,實驗前用磷酸鹽緩沖液(PBS)新鮮配制, 濃度為5 g/L,過濾除菌后4避光保存,1 wk內(nèi)使用. 二甲基亞砜(DMSO, 北京索萊寶公司)； 倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS TH4200)；超凈工作臺(AIR TECH,蘇凈集團(tuán)安泰公司)；CO2培養(yǎng)箱(HERA cell 150, Germany)；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC,丹麥).1.2方法1.2.1浸提液制備將無菌濾紙裁成1 cm×1 cm試樣備用, 按每面涂50 L的粘接劑使濾紙浸漬均勻,清潔空氣輕吹23 min,待粘接劑由白色乳液變至無色透明膠膜,依照ISO 1099312樣品制備要求5,試

6、樣按表面積與浸提介質(zhì)比6 cm2/mL加入含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液中,另將未涂粘接劑的無菌濾紙作為陰性對照按同樣比例浸于相同培養(yǎng)液,放置在37，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)浸提72 h,分別得到1000 mL/L FPSA1浸提液和陰性對照組浸提液,過濾除菌. 再將1000 mL/L浸提液經(jīng)DMEM培養(yǎng)液稀釋成500，750 mL/L濃度浸提液備用.1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)將對數(shù)生長期的L929細(xì)胞經(jīng)2.5 mL/L胰酶消化、吹打分散后計數(shù),用含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液配成濃度為1×107/L的細(xì)胞懸液,按每孔100 L的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板上,放

7、入37，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中. 四周邊緣孔不接種細(xì)胞,每孔加入100 L的DMEM培養(yǎng)液,起邊緣封閉作用.1.2.3MTT測試細(xì)胞培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)液,用PBS洗滌2次,進(jìn)行培養(yǎng)液交換,按每孔200 L分別加入500，750 mL/L的FPSA1浸提液,另設(shè)陰性和陽性對照組,分別加入等量無菌濾紙浸提液和含6.4 mL/L苯酚的培養(yǎng)液,每組重復(fù)6孔,常規(guī)培養(yǎng),每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖情況. 分別于加樣后2，4，7 d取出96孔板,在受試孔中每孔加入20 L的MTT溶液,37，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中保溫4 h后棄去舊液,每孔加入150 L的DMSO,振蕩10 m

8、in,在多道掃描酶標(biāo)儀上測A490 nm值,計算細(xì)胞的相對增殖率(RGR). RGR(%)=(實驗組A490 nm/陰性對照組A490 nm)×100%,細(xì)胞毒性分級按如下標(biāo)準(zhǔn)6評價: RGR100為0級;8099為1級;5079為2級;3049為3級;029為4級.統(tǒng)計學(xué)處理：用SPSS12.0統(tǒng)計分析軟件,對數(shù)據(jù)采用方差分析和Tukey多重比較檢驗 (=0.05).     08-10-15 13:24:00     編輯：studa202結(jié)果2.1MTT測定加樣后2，4，7 d,陽性對照組與其余各組

9、的A值之間均有顯著性差異(P<0.01), 500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液組之間A490 nm差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)；在各時相500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液組的RGR均大于80%,參照標(biāo)準(zhǔn)評分FPSA1的細(xì)胞毒性為1級,各組細(xì)胞RGR及毒性評級結(jié)果見表2.表1FPSA1與對照組的A490 nm值（略）bP<0.01 vs 陰性對照， 500 mL/L FPSA1，750 mL/L FPSA1. FPSA1: 顏面贗復(fù)體粘接劑1.表2FPSA1與對照組的RGR及細(xì)胞毒性等級（略）bP<0.01 vs 陰性對照，5

10、00 mL/L FPSA1，750 mL/L FPSA1. FPSA1: 顏面贗復(fù)體粘接劑1.2.2倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況加樣后2，4，7 d,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，陰性對照組L929細(xì)胞形態(tài)正常,呈梭形,細(xì)胞突充分伸展,隨著時間延長,細(xì)胞數(shù)量增加(圖1A)；500 mL/L FPSA1浸提液組細(xì)胞形態(tài)正常,生長良好,750 mL/L FPSA1浸提液組局部可見少量細(xì)胞出現(xiàn)溶解或壞死(圖1B,C)；陽性對照組細(xì)胞數(shù)量明顯減少,大量細(xì)胞出現(xiàn)固縮、壞死、崩解(圖1D).3討論由于生物材料容易浸出能引起組織反應(yīng)或炎癥反應(yīng)的物質(zhì),這些物質(zhì)大多是原料單體、小分子聚合物、溶劑等,所以生物材料

11、在應(yīng)用于人體之前,都必須經(jīng)過嚴(yán)格的檢驗,除臨床應(yīng)用所要求的機(jī)械及理化性能外,還應(yīng)具備良好的生物相容性7. 國際標(biāo)準(zhǔn)化組織發(fā)布了ISO 10993醫(yī)療器械生物學(xué)評價系列標(biāo)準(zhǔn)中,細(xì)胞毒性試驗以其簡便、快捷、靈敏性高、節(jié)省動物等優(yōu)點被列為首選試驗項目.MTT法應(yīng)用材料浸提液檢測其細(xì)胞毒性,對受試材料溶出物的毒性檢測敏感性較高,也比較符合動物體內(nèi)的毒性實驗結(jié)果,是一種較好的體外評價生物材料細(xì)胞毒性的研究方法8. L929細(xì)胞具有傳代穩(wěn)定、繁殖迅速、體外培養(yǎng)條件低、能為許多材料細(xì)胞毒性所共用等優(yōu)點,成為細(xì)胞毒性試驗中應(yīng)用最早且使用最廣泛的細(xì)胞.A: 陰性對照組； B： 50 mL/L FPSA1浸提液組

12、； C： 750 mL/L FPSA1浸提液組; D: 陽性對照組.圖1倒置顯微鏡觀察加樣后7 d各組L929細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化×100（略）我們采用500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液進(jìn)行MTT實驗,以檢測細(xì)胞毒性是否與材料溶出物有關(guān),以及溶出物濃度與細(xì)胞毒性的劑量依賴關(guān)系,可以比較全面地評價FPSA1的細(xì)胞毒性. 經(jīng)500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液培養(yǎng)的L929細(xì)胞,在加樣2，4和7 d后,細(xì)胞RGR均在80%以上,細(xì)胞毒性為1級,各濃度浸提液組之間RGR無顯著差異,提示L929細(xì)胞增殖與FPSA1浸提液的濃度無明顯相關(guān)，符合生物材料的醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn).

13、與陰性對照組相比,750 mL/L FPSA1浸提液組局部出現(xiàn)少量細(xì)胞溶解或壞死，這可能是由于在細(xì)胞毒性試驗中,通常隨著浸提液濃度的增加,細(xì)胞毒性也會相應(yīng)增加的緣故9.FPSA1為有機(jī)硅改性的聚丙烯酸酯類粘接劑,是用含雙鍵的有機(jī)硅單體與丙烯酸酯單體,通過自由基引發(fā)的乳液聚合反應(yīng)合成的. 在聚合反應(yīng)過程中加入了離子型和非離子型的乳化劑,其中離子型乳化劑在制備粘接劑浸提液時可促進(jìn)膠膜吸水溶解,使得粘接劑膠膜中殘留的丙烯酸酯單體或其它助劑析出,從而表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞毒性. 我們的結(jié)果提示在粘接劑合成過程中應(yīng)盡量提高共聚單體功能團(tuán)的交聯(lián)程度即提高單體轉(zhuǎn)化率,或采取相應(yīng)措施以減少粘接劑中的單體殘留，同時還

14、應(yīng)提高顏面贗復(fù)體粘接劑的耐水性能. 這一方面可通過提高聚合物中有機(jī)硅的含量來實現(xiàn),另一方面可以在乳液聚合反應(yīng)中使用反應(yīng)型乳化劑以減少離子型乳化劑的使用量. 反應(yīng)型乳化劑在乳化劑分子中含有能發(fā)生自由基聚合反應(yīng)的雙鍵,在反應(yīng)時參與單體共聚,不以游離聚合物粒子形式存在,從而改善粘接劑的性能5,8.綜上所述，本研究采用MTT法評價細(xì)胞毒性,其結(jié)果顯示FPSA1無明顯的細(xì)胞毒性,具有良好的細(xì)胞相容性,是一種具有發(fā)展前景的顏面贗復(fù)體粘接材料.【參考文獻(xiàn)】  1 Chang TL, Garrett N, Roumanas E, et al. Treatment satisfaction with

15、facial prostheses J. J Prosthet Dent, 2005,94(3):275-280.2 KiatAmnuay S, Gettleman L, Goldsmith LJ. Effect of multiadhesive layering on retention of extraoral maxillofacial silicone prostheses in vivo J. J Prosthet Dent, 2004,92(3):294-298.3 Dahl JE, Polyzois GL. Irritation test of tissue adhesives

16、for facial prosthesesJ. J Prosthet Dent, 2000,84(4):453-457.4 ISO 109935: Biological evaluation of medical devicesPart 5: Tests for in vitro cytotoxicity S. 2003.5 ISO 1099312: Biological evaluation of medical devicesPart 12: Sample preparation and reference materials S. 2003.6 USPC.Biological Tests/Biological Reactivity Tests,in vitro S.2004.7 郝和平. 醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)實施指南M. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2000:100-101.8 Richardson RR Jr, Miller JA, Reichert MW. Polyimides as