生物技術(shù)交底書模板

1、.技術(shù)交底書模板 - 生物類1. 發(fā)明創(chuàng)造名稱：應(yīng)簡(jiǎn)單明確地描述發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，可按其技術(shù)特點(diǎn)、用途或技術(shù)和用途雙重命名，發(fā)明創(chuàng)造名稱不得超過25 個(gè)字，避免使用宣傳性、廣告性詞匯。一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法2背景技術(shù)及現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足：背景技術(shù)：是對(duì)最接近的現(xiàn)有技術(shù)的說明，可分為大的背景技術(shù)和小的背景技術(shù)兩個(gè)方面進(jìn)行介紹，大的背景技術(shù)主要指該技術(shù)領(lǐng)域的總體狀況，小的背景技術(shù)指與本發(fā)明改進(jìn)的具體技術(shù)密切相關(guān)的技術(shù)狀況；背景技術(shù)的詳細(xì)程度，以不需要再去看文獻(xiàn)即可理解該技術(shù)密切相關(guān)的技術(shù)狀況，如果現(xiàn)有技術(shù)出自專利文獻(xiàn)、期刊、書籍，則提供出處?，F(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足：1. 客觀

2、評(píng)價(jià)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，會(huì)帶來哪些問題，這些缺點(diǎn)是針對(duì)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)來說的，本發(fā)明正是要解決這些問題和缺點(diǎn)；本發(fā)明無法解決的技術(shù)問題不必描述，本發(fā)明不能解決的缺點(diǎn)也不必寫；2. 如果找不出對(duì)比技術(shù)方案及其缺點(diǎn)，可用反推法，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)來找出由對(duì)應(yīng)的缺點(diǎn)，還可以從結(jié)構(gòu)角度推導(dǎo)出現(xiàn)有先進(jìn)產(chǎn)品的缺點(diǎn)；3. 缺點(diǎn)可以是代謝產(chǎn)物性能差、產(chǎn)量低、菌種穩(wěn)定性不高等類似問題；針對(duì)前面現(xiàn)有技術(shù)的所有缺點(diǎn)，逐一正面描述本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題。近年來， 非結(jié)核分枝桿菌感染明顯增加，結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌在臨床上引起的疾病難以區(qū)別，最具代表性的結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病酷似非結(jié)核分枝桿菌肺病，但兩者對(duì)抗結(jié)核藥物敏感性不同

3、，故正確鑒定分枝桿菌在疾病診斷及治療中至關(guān)重要。傳統(tǒng)的生物學(xué)鑒定方法主要依據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)速度、色素產(chǎn)生、對(duì)藥物耐受性、生化反應(yīng)等，方法復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，在得到分離培養(yǎng)物后仍需24 周方能獲得結(jié)果，因此有必要建立一種快速診斷結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法，對(duì)結(jié)核病確證及臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義。目前鑒別結(jié)核分枝桿菌的分子生物方法有PCR， ELISA 、免疫;.膠體金等方法，以上各種方法雖然可能在臨床上提供較好的價(jià)值，但因需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的操作過程、靈敏度低等不同的原因未能在臨床上大規(guī)模推廣使用。環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplificati

4、on ，以下簡(jiǎn)稱 LAMP 法）是日本榮研化學(xué)株式會(huì)社于2000 年前后開發(fā)出的基因擴(kuò)增技術(shù)，其具有快速簡(jiǎn)便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，目前尚未有將LAMP 法應(yīng)用于快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌。3具體的技術(shù)方案描述：本部分所提供的內(nèi)容涉及專利申請(qǐng)文件中最重要的部分，越詳細(xì)越好。對(duì)于發(fā)明專利要求保護(hù)的主題是一個(gè)技術(shù)方案，因而在這部分應(yīng)當(dāng)闡述本發(fā)明要解決的技術(shù)問題（即發(fā)明目的）是通過什么樣的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，不能只有原理和功能介紹，應(yīng)當(dāng)詳細(xì)描述本發(fā)明的各個(gè)發(fā)明改進(jìn)點(diǎn)及相應(yīng)的技術(shù)方案。技術(shù)方案應(yīng)當(dāng)通過清楚、完整地描述本發(fā)明的技術(shù)特征（如菌種名稱、微生物生物學(xué)特性、應(yīng)用效果試驗(yàn)方法

5、及證明數(shù)據(jù)等），使本專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員不需通過創(chuàng)造性勞動(dòng)能夠?qū)嵤┍景l(fā)明為準(zhǔn)。對(duì)于不同類型的發(fā)明，需要采用不同的描述方式來說明其技術(shù)方案。例如：（）涉及“微生物”發(fā)明的要求應(yīng)當(dāng)包含微生物名稱的描述：對(duì)于新菌株的情況，微生物的分類學(xué)名稱相應(yīng)為種名+菌株名，種名采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)命名法命名，菌株名由申請(qǐng)人自己命名，例如：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y-1 ；生物保藏情況體現(xiàn)：對(duì)于新的微生物，應(yīng)當(dāng)注明“菌株名+保藏單位簡(jiǎn)稱+保藏號(hào)”，例如：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） Y-1 ，已于 1993 年 9 月 8 日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保

6、藏中心，其簡(jiǎn)稱為CCTCC，保藏編號(hào)為No.M93049；微生物的生物學(xué)特性的記載：包括形態(tài)學(xué)特性、培養(yǎng)特性、生理特性和代謝特性等；制造微生物的方法：描述應(yīng)當(dāng)以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠制造為準(zhǔn)，通常包括篩選、誘變、DNA 重組技術(shù)等；記載一種微生物的應(yīng)用效果：必須在說明書中提供試驗(yàn)證據(jù)來證實(shí)微生物的用途和實(shí)用效果。（）涉及重組DNA技術(shù)發(fā)明的要求涉及 DNA分子本身的發(fā)明 DNA分子的詳細(xì)結(jié)構(gòu)（可以是堿基序列表示）、分子類型及來源等；制備過程，包括工藝及條件、收集純化步驟、鑒定方法等；功能和用途，證實(shí)這種功能和用途的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。涉及載體的發(fā)明制備過程，包括起始載體、制備重組的方法步驟、所用酶、處

7、理?xiàng)l件等；最好描繪構(gòu)建重組載;.體的過程的示意圖。涉及多肽本身的發(fā)明對(duì)多肽或蛋白質(zhì)的名稱、結(jié)構(gòu)、制備方法和蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行描述。涉及轉(zhuǎn)化體及其制備方法的發(fā)明描述導(dǎo)入的基因或重組載體、宿主、導(dǎo)入方法、收集轉(zhuǎn)化體的方法及鑒定方法等。本發(fā)明的目的在于提供一組用于快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的特異性引物，及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)（ LAMP 技術(shù)）快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法。本鑒定方法方便快捷、價(jià)格低廉，適于推廣應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：本發(fā)明根據(jù)結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌 16S RNA 的特異性設(shè)計(jì) 4 條特異性引物， 利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

8、，在 60 65，等溫?cái)U(kuò)增 6090 分鐘，根據(jù)顯色劑顯示的顏色來區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌。用于快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的特異性引物，包括：內(nèi)引物 1： 5-TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGA TCTGCACACAGCT -3（ SEQ ID No.1 ）；內(nèi)引物 2： 5- TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG -3（ SEQ ID No.2 ）；外引物 1： 5-TCATCGCCGATCATCAGG -3（ SEQ ID No.3 ）；外引物 2： 5-CGAGTTTGGTCA TCAGCCG- 3（ SEQ

9、 ID No.4 ）。一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法，具體包括如下步驟：（ 1）模板 DNA 的提取： 提取待檢樣品的 DNA ，所述待檢樣品是已鑒定為含有分枝桿菌的樣品或分離的分枝桿菌；（ 2）環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)：在 200l PCR 管配制反應(yīng)體系： 引物混合液1l，反應(yīng)液 12.5 l，DNA 聚合酶 0.51 l，模板 DNA 25 l ，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25l，然后加入20l 的密封液，將上述反應(yīng)管于6365反應(yīng) 6090min ；所述引物混合液含有上述的4 條特異性引物（SEQ ID No.14 ），其中，內(nèi)引物1 的濃度為48 pmol/l、內(nèi)引物2 的濃

10、度為48 pmol/l、外引物1 的濃度為1 pmol/l、外引物2 的濃度為1 pmol/l；所述反應(yīng)液含有10mM dNTP 、10×ThermoPol 反應(yīng)緩沖液、 150mM MgSO4 、 5mM Betaine ，四者的體積比為79： 5： 24： 911；;.（ 3）結(jié)果判斷：在上述反應(yīng)管中加入 12l 顯色劑 SYBR GREEN ，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為結(jié)核分枝桿菌，橙色則為非結(jié)核分枝桿菌。所述反應(yīng)液中， 10mM dNTP ：10×ThermoPol 反應(yīng)緩沖液： 150mM MgSO4 ：5mM Betaine （體積比） =8 ： 5

11、： 3： 10。所述 DNA 聚合酶為Bst DNA 聚合酶，濃度為8U/ l。4本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)點(diǎn)：針對(duì)上述“現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足”并結(jié)合技術(shù)方案中的各個(gè)發(fā)明改進(jìn)點(diǎn)作出具體說明，即以推理方式具體分析各個(gè)改進(jìn)點(diǎn)如何帶來這些優(yōu)點(diǎn)，使得對(duì)優(yōu)點(diǎn)的說明做到有理有據(jù)；通過對(duì)發(fā)明的分析和理論說明相結(jié)合，或?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)說明，它可以是產(chǎn)率或療效的提高、能耗、原材料、工序的節(jié)省，操作、控制、使用的簡(jiǎn)便，降低毒副作用，減少環(huán)境污染、代謝產(chǎn)物有藥用價(jià)值、產(chǎn)量高、菌種存活使用時(shí)間長(zhǎng)等。本發(fā)明方法方便快捷，能在較短的時(shí)間內(nèi)鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，且不需要昂貴的儀器設(shè)備；靈敏度高，最低可檢測(cè)出100 個(gè)菌 /ml；特

12、異性好，本發(fā)明根據(jù)16S RNA 基因序列設(shè)計(jì) 4 對(duì)引物，與目的基因的 6 個(gè)區(qū)域結(jié)合，具有較高的特異性。本發(fā)明對(duì)于結(jié)核分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌感染的診斷與臨床用藥具有較高的參考價(jià)值，適于推廣應(yīng)用。5具體實(shí)施方式及附圖：具體實(shí)施方式：（ 1）微生物：應(yīng)給出微生物的獲取方式、篩選過程、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、用途和效果的證明方法等；（ 2） DNA重組：源基因的獲取方法、重組制備方式、工藝條件、純化步驟、鑒定方法等。具體實(shí)施方式應(yīng)與技術(shù)方案相一致，并且應(yīng)當(dāng)對(duì)權(quán)利要求書的技術(shù)特征給予詳細(xì)說明，以支持權(quán)利要求書（有多種實(shí)施方式時(shí)，提供多個(gè)實(shí)施例）；還應(yīng)給出相關(guān)性能、效果表征的數(shù)據(jù)等。附圖：基因工程圖譜（包

13、括 HPLC圖譜、實(shí)驗(yàn)曲線、基因重組、電泳圖譜等） ，并針對(duì)附圖進(jìn)行說明。實(shí)施例環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)體系的準(zhǔn)備：（ 1）反應(yīng)液： 10mM dNTP 、10×ThermoPol 反應(yīng)緩沖液、 150mM MgSO4 、 5mM Betaine ，四者的體積比為 8： 5： 3： 10；;.（ 2）引物液：包括 4pmol/ l 內(nèi)引物 1、 4pmol/ l 內(nèi)引物 2、 1 pmol/ l外引物 1、1 pmol/ l外引物2，四條引物分別為：內(nèi)引物 1：5 -TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT-3（SEQ IDNo.1 ）；內(nèi)引物

14、 2：5 -TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG-3（SEQ IDNo.2 ）；外引物 1：5 -TCATCGCCGATCATCAGG-3（SEQ IDNo.3 ）；外引物 2：5 -CGAGTTTGGTCATCAGCCG（-3SEQ IDNo.4）；（ 3）DNA聚合酶： Bst DNA聚合酶，濃度為 8U/l ；（ 4）顯色劑：熒光染料1× SYBR GreenI 。用上述反應(yīng)體系按以下方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行鑒定。本實(shí)施例的待檢樣品為已鑒定為分枝桿菌患者的痰液，當(dāng)然，也可以為已鑒定為分枝桿菌患者的支氣管灌洗液及其它樣品，或者分離的分枝桿菌。1、模板 DNA提?。?）將 3ml 的痰標(biāo)本置于室溫；2）在痰樣標(biāo)本中加入2 倍痰樣體積的4%的 NaOH；3）每隔 2min 渦旋振蕩15s ，處理 15min，然后吸取1ml 加入帶旋蓋的離心管中；4）12000r/min離心 15min ，去上清液；5）加入 0.9%的 NaCl1ml ，洗滌， 12000r/min離心 15min，去上清液；6）加入 100l的純化水；7）100煮 20min，然后冰浴10min ；8）離心取上清液轉(zhuǎn)移至另一支離心管中作為模板DNA。2、環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)