大黃酚對腦缺血再灌注小鼠記憶功能的保護作用

1、大黃酚對腦缺血再灌注小鼠記憶功能的保護作用                         作者：王樹 張丹參 張力 安芳 薛貴平 武海霞【摘要】 目的 研究大黃酚對腦缺血再灌注(I/R)小鼠記憶功能的保護作用及其機制。方法 采用改進的Himori法暫時性阻斷兩側(cè)頸總動脈制備小鼠腦I/R損傷模型，進行穿梭實驗，觀察大黃酚(10.0、1.0、0.1 mg/kg

2、，腹腔注射)對腦I/R小鼠記憶功能的保護作用，并對各劑量組腦組織和血液中谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)、超氧化物歧化酶(SOD)活力進行測定，以及小鼠亞硝酸鈉中毒缺氧后存活時間的測定。結(jié)果 大黃酚可明顯改善腦I/R損傷所致的記憶障礙，增加GSHPx、SOD活力，延長缺氧后存活時間。結(jié)論 大黃酚對腦I/R損傷小鼠記憶功能有保護作用，其作用機制可能是通過增強GSHPx、SOD活力，提高腦組織對氧自由基的清除能力，從而減輕I/R引起的腦組織損傷。 【關(guān)鍵詞】 大黃酚;腦缺血再灌注;學(xué)習(xí)記憶;谷胱甘肽過氧化物酶;超氧化物歧化酶;缺氧以往研究證明，大黃酚可顯著抑制大鼠肝、腦組織過氧化脂質(zhì)的生成，具有抗

3、衰老作用1。但大黃酚對腦缺血再灌注(I/R)記憶功能的影響，尚未見報道。本實驗旨在采用改進的Himori法2暫時性阻斷兩側(cè)頸總動脈制備小鼠腦I/R損傷模型，研究大黃酚對腦I/R小鼠記憶功能的保護作用，探討其對腦I/R損傷后記憶功能的保護作用機制，為其應(yīng)用于臨床治療血管性癡呆疾病提供理論和實驗依據(jù)。1 材料與方法1.1 動物 昆明種小鼠，體重 (28±2)g，均為雄性，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動物實驗中心提供許可證號：SCXK(京)20040001。1.2 主要藥品、試劑和儀器 大黃酚(純度98%，批號110796200412，中國藥品生物制品檢定所)，實驗前用N，N二甲基甲酰胺溶解

4、，聚山梨酯80助溶，生理鹽水稀釋至所需濃度，N，N二甲基甲酰胺聚山梨酯80生理鹽水的比例為118。谷光甘酞過氧化物酶(GSHPx)活力測試盒，超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所);亞硝酸鈉(NaNO2)(天津市化學(xué)試劑一廠)。XCS2小鼠穿梭程序自動控制儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);753BI微機型紫外可見分光光度計(上海光學(xué)儀器制造廠);Forma86c ULT 冰柜(-80，美國熱電公司);Sigma3K30高速冷凍離心機(德國Sigma公司)。1.3 方法1.3.1 小鼠腦I/R模型的制備 在Himori法2基礎(chǔ)上進行改進。3.5%水合氯醛(10 ml/kg,腹腔注

5、射)麻醉小鼠后，仰臥位固定，自胸骨柄到下頜骨間行58 mm正中縱向切口，分離兩側(cè)頸總動脈，分離后用液體石蠟浸泡過的黑色手術(shù)線穿過左右二側(cè)頸總動脈，盡量恢復(fù)兩側(cè)頸總動脈到原位，在氣管上方輕輕將黑色手術(shù)線打一松的反手結(jié)，結(jié)的松緊以不壓迫氣管為宜。在每側(cè)頸總動脈上方的黑線上穿過一條用液體石蠟浸泡過的白色手術(shù)線，按Himori法埋線后縫合切口。術(shù)后48 h將頸下部黑色手術(shù)線拉緊,阻斷兩側(cè)頸總動脈造成大腦缺血狀態(tài)，5 min后輕拉兩側(cè)白色手術(shù)線，使頸總動脈恢復(fù)血液再灌注。1.3.2 動物分組及給藥 每項實驗均取小鼠70只，手術(shù)后48 h將小鼠隨機分為5組，假手術(shù)組(進行手術(shù)，但不進行腦I/R)、I/R模

6、型組(模型組)、藥物組(模型+大黃酚);藥物組分高、中、低劑量組，于缺血前30 min分別腹腔注射大黃酚10.0、1.0、0.1 mg/kg，模型組于缺血前30 min 腹腔注射溶劑10 ml/kg，假手術(shù)組腹腔注射溶劑10 ml/kg。1.3.3 穿梭實驗 XCS2小鼠穿梭程序自動控制儀，底部為不銹鋼柵，柵間距為0.5 cm，加非條件刺激時有電流通過，電擊動物足底。頂部配置有噪聲發(fā)生器(鈴聲刺激)，用來產(chǎn)生條件刺激。在安靜環(huán)境中，每天8:0012:00進行實驗，室溫(22±2)。程序設(shè)置為：蜂鳴5 s，繼之電刺激15 s，間隔15 s,而后重復(fù)上述程序,如此循環(huán)20次。電腦將自動記

7、錄小鼠遭受電擊次數(shù)、電擊時間及主動逃避時間等參數(shù)，以評價小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。每次實驗測試前先把小鼠放入穿梭箱中，讓小鼠在箱內(nèi)自由活動5 min，以消除其探究反射。然后正式進行學(xué)習(xí)穿梭訓(xùn)練，記錄小鼠被電擊次數(shù)、電擊時間和主動逃避時間。除假手術(shù)組外，其余各組于訓(xùn)練后使腦缺血5 min，然后恢復(fù)血流。24 h后測試記憶成績。                        &

8、#160;    1.3.4 小鼠全血、腦組織GSHPx和血漿、腦組織SOD活力測定 除假手術(shù)組外，其余各組均于48 h后立即缺血5 min，然后恢復(fù)血供后10 min，將小鼠的頸動脈切開取血,肝素抗凝，并快速斷頭取其腦組織置于Forma86c ULT 冰柜內(nèi)冷凍貯存。將抗凝全血用三蒸水制成1%溶血液，并將腦組織制成10%腦勻漿。以GSHPx試劑盒測定小鼠全血及腦組織中GSHPx活力。以SOD試劑盒測定小鼠血漿中SOD活力和10%腦勻漿組織SOD活力。1.3.5 小鼠亞NaNO2中毒實驗 除假手術(shù)組外，其余各組均于手術(shù)后48 h阻斷血流5 min，然后恢

9、復(fù)血流。24 h后參照文獻方法3，各組立即腹腔注射 NaNO2 240 mg/kg，并開始記錄，以5 s內(nèi)不再張口呼吸為觀察指標(biāo)。1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行方差分析和t檢驗。2 結(jié) 果2.1 大黃酚對腦I/R小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 表1結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠表現(xiàn)出明顯的記憶功能障礙。小鼠被電擊次數(shù)明顯增加，電擊時間明顯延長(P<0.01)，主動逃避時間明顯延長。腦缺血前給予大黃酚，與模型組相比，高、中劑量組缺血后小鼠被電擊次數(shù)明顯減少，電擊時間明顯縮短，主動逃避時間縮短(P<0.01，P<0.05)。說明其對

10、模型組所致記憶功能障礙有明顯的保護作用。2.2 大黃酚對腦I/R小鼠腦組織中GSHPx和SOD活力的影響 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦內(nèi)、全血、血漿中GSHPx、SOD活力明顯降低(P<0.01);而腦缺血前給予大黃酚可使小鼠腦內(nèi)GSHPx、SOD活力明顯提高(P<0.01，P<0.05)(表2)。2.3 大黃酚對腦I/R小鼠全血中GSHPx活力和血漿中SOD活力的影響 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠全血中GSHPx活力和血漿中SOD活力明顯降低(P<0.01);而腦缺血前給予大黃酚可使小鼠全血中GSHPx和血漿中SOD活力明顯提高(P<0.01)(表2)。表1 大黃

11、酚對模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與假手術(shù)組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01,3)P<0.05，下表同表2 大黃酚對模型小鼠腦組織GSHPx、SOD、全血GSHPX和血漿SOD活力的影響(2.4 大黃酚對腦I/R小鼠NaNO2中毒后存活時間的影響 與假手術(shù)組比較(14.5±0.8) min，模型組小鼠存活時間明顯縮短(9.4±0.7) min(P<0.01)。與模型組相比，預(yù)先給予大黃酚使腦模型小鼠由于亞硝酸鈉中毒缺氧后存活時間明顯延長，高劑量(13.2±0.6) min(P<0.01),中劑量(10.1±

12、0.5) min(P<0.05)，但與低劑量(10.1±0.7) min無顯著差異，說明腦I/R小鼠由于NaNO2中毒所致耐缺氧的能力減弱，大黃酚能提高小鼠耐缺氧能力。3 討 論學(xué)習(xí)記憶障礙是血管性癡呆患者普遍的臨床表現(xiàn)。本實驗顯示，腦I/R損傷可引起小鼠記憶功能障礙，在穿梭實驗中，小鼠被電擊次數(shù)明顯增加，電擊時間明顯延長，主動逃避時間明顯延長。而腦缺血前預(yù)先給予大黃酚則有明顯保護作用。提示大黃酚可能有助于改善缺血性腦血管病的預(yù)后，降低血管性癡呆的嚴(yán)重程度或減少其發(fā)生。腦I/R損傷與自由基的生成、細胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸毒性、白細胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有關(guān)，特別是

13、氧自由基損傷引發(fā)脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)是I/R腦損傷的重要發(fā)病機制。腦是富含脂質(zhì)的組織，比其他組織對自由基更為敏感。腦缺血時，由于ATP減少,造成細胞膜泵功能失靈,Ca2+進入細胞激活Ca2+依賴的蛋白水解酶,使黃嘌呤脫氫酶(XD)大量變?yōu)辄S嘌呤氧化酶(XO)，同時ATP釋放能量而分解,使ADP、AMP含量升高，并依次分解產(chǎn)生大量次黃嘌呤。在灌注時，大量的分子氧隨血液進入缺血腦組織，XO在催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤和尿酸的同時,產(chǎn)生大量O2和H2O2，而H2O2在金屬離子的參與下形成·OH，造成氧自由基(OFR)爆發(fā)性增加4。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠腦組織中SOD和GSHPx活性顯著降低

14、，預(yù)先給予大黃酚可使SOD和GSHPx活性顯著升高，表明大黃酚可提高機體抗氧化酶的活性，減輕氧自由基對細胞的損傷。本課題組以往的研究表明，大黃酚對離體大鼠肝和腦組織過氧化脂質(zhì)有明顯的抑制作用1，進一步印證大黃酚對腦I/R小鼠記憶功能的保護作用機制可能是減少自由基對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。                           &#

15、160; 亞硝酸鈉屬強氧化劑，可致高鐵血紅蛋白血癥，破壞血紅蛋白攜氧能力，引起氧的運送障礙而導(dǎo)致組織器官缺氧，進而窒息死亡。腦的活動主要依靠葡萄糖的有氧氧化提供能量，它是一個對缺氧最敏感的器官，一旦腦缺血達到一定程度，再灌流不僅不能使缺血區(qū)代謝和機能得以恢復(fù)反而加重腦水腫及擴大腦梗死面積。本研究表明，模型組小鼠亞硝酸鈉中毒后存活時間明顯縮短，而預(yù)先給予大黃酚則使小鼠中毒后存活時間明顯延長，證實大黃酚具有抗缺氧作用。有實驗表明5，大黃酚劑量依賴地抑制苯腎上腺素誘導(dǎo)的豚鼠胸主動脈環(huán)血管收縮反應(yīng)，降低最大收縮力，顯示非競爭性阻斷作用;大黃酚也可抑制組胺誘導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)，使最大反應(yīng)降低19

16、.2%，且明顯抑制KCl誘導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)，最大收縮力降低18.8%。提示大黃酚抗缺氧作用可能與擴張血管，增加血流量，提高血氧水平有關(guān)，詳細機制在以后的實驗研究中將進一步闡明。本研究證明，大黃酚對腦I/R小鼠的記憶功能有一定的保護作用，為其應(yīng)用于臨床治療血管性癡呆疾病提供實驗依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】 1 張丹參,張 力,薛貴平,等.大黃酚的抗衰老作用J.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2005;25(1):157.2 Himori N,Watanabe H,Akaike N,et al.Cerebral ischemia model with conscious mice：involvement of NMDA receptor activation and derangement of learning and memory abili