大豆黃酮在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用

1、肽的生產(chǎn)方法和肽產(chǎn)品中苦味的消除措施河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 徐 兵 王成章河北寶恩生物科技有限公司 劉金猛 肽是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，氨基酸是構(gòu)成肽的基本基團(tuán)，分子間通過肽鍵相連接，它是蛋白質(zhì)降解過程中的中間產(chǎn)物。含氨基酸殘基50以上的通常稱為蛋白質(zhì)，低于50個(gè)氨基酸殘基的稱為肽，肽中氨基酸殘基低于10個(gè)的稱為寡肽，含2或3個(gè)氨基酸殘基的為小肽、低聚肽，也稱小分子活性肽，其分子量分子量在18010000之間。 小肽在動(dòng)物營養(yǎng)上有著重要的作用。一方面，一些肽類可以滿足動(dòng)物特殊的營養(yǎng)需要能夠促進(jìn)動(dòng)物生長，提高飼料利用率，使動(dòng)物獲得良好的生產(chǎn)性能。另一方面，某些肽類作為飼料添

2、加劑能抑制外源性病原菌，而對動(dòng)物腸道中共生生態(tài)系統(tǒng)中的微生物和動(dòng)物細(xì)胞無破壞作用，從而起到保護(hù)動(dòng)物的健康增加畜牧業(yè)的綜合效益。 1、肽的種類及其生理、營養(yǎng)作用 肽從其功能上可以簡單的分為2種：功能性小肽和營養(yǎng)性小肽。營養(yǎng)性小肽，指只作為蛋白合成的原料并有利于氨基酸吸收但不具備其它一些生理活性的肽類。而生物活性肽是指對生物機(jī)體的生命活動(dòng)有具有特殊生理活性的一大類肽。由生物體自身的組織或器官產(chǎn)生的對其本身有生理調(diào)節(jié)作用的肽類稱為內(nèi)源性生物活性肽；而非機(jī)體自身產(chǎn)生的，以肽的形式被吸收后具有生物活性的肽類物質(zhì)稱為外源性生物活性肽主要起著調(diào)節(jié)動(dòng)物體消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌、免疫機(jī)能的生物活性作用。近年

3、來的研究表明小肽在動(dòng)物的營養(yǎng)和生理上起著重要的作用： 1.1 小肽可以促進(jìn)氨基酸和礦物質(zhì)的吸收肽的吸收方式不同于游離氨基酸的吸收，它具有速度快、不易飽和、避免了同氨基酸競爭等特點(diǎn)，因而有利于機(jī)體吸收，這在很多試驗(yàn)中已經(jīng)得到證明。例如施用輝在研究不同比例小肽與游離氨基酸對雞氨基酸吸收的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)完全以小肽的形式供給動(dòng)物時(shí)，賴氨酸的吸收速度不再受精氨酸的影響。小肽有利于礦物質(zhì)的吸收是由于小肽能與Ca、Fe、Cu、Zn等金屬以螯合物形式結(jié)合，通過小腸絨毛刷狀緣，以小肽的形式促進(jìn)這些金屬元素的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收。 1.2 功能性小肽還具有很多的生理學(xué)活性如抗菌活性、免疫活性、抗氧化作用、抗高血壓作用和降膽

4、固醇作用，這些生物活性的實(shí)現(xiàn)和肽的種類、來源都有很強(qiáng)的聯(lián)系。2、小肽的生產(chǎn)方法 由于小肽結(jié)構(gòu)的被闡明，生物技術(shù)、化學(xué)合成和基因工程的發(fā)展，小肽的生產(chǎn)和工藝有了許多的改進(jìn)和創(chuàng)新?，F(xiàn)在的肽類制品主要有以下幾種生產(chǎn)方法： 2.1 蛋白質(zhì)的降解 蛋白質(zhì)的降解是現(xiàn)在生產(chǎn)肽類的主要方法，但根據(jù)其具體操作工藝有可以細(xì)化為以下幾個(gè)具體類型： 2.1.1 酶解法 是以蛋白質(zhì)為底物并選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌?，將蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，即可得到大量的具有各種生理功能的生物活性肽。此法產(chǎn)生的小肽分子量約在3000D左右，具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，而酶解所要求的條件較難控制，因此要注意與小肽酶解生產(chǎn)效果密切相關(guān)的因素如溫度、pH值、酶濃度

5、、底物濃度、時(shí)間等。但最為關(guān)鍵的是酶的選擇，一般可選用胃蛋白酶等動(dòng)物蛋白酶，也可使用菠蘿和木瓜等植物蛋白酶。通過選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌?，可以獲得大量具有各種功能的肽。但動(dòng)物蛋白和植物蛋白水解后的產(chǎn)物有所不同的是動(dòng)物蛋白可釋放較大比例的肽，而植物蛋白釋放較多的為游離氨基酸，為此酶解底物以選擇高品質(zhì)的動(dòng)物蛋白為宜。此種方法雖然在工業(yè)上應(yīng)用較廣但是產(chǎn)品中帶有苦味，對產(chǎn)品的品質(zhì)的提高帶來了一定的影響。 2.1.2 微生物發(fā)酵法 是把蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)和蛋白的酶解生產(chǎn)結(jié)合在一起生產(chǎn)肽的一種辦法，從本質(zhì)上講它也是一種酶解法。這種生產(chǎn)方法降低了小肽的生產(chǎn)成本，應(yīng)用前景很好。此方法的關(guān)鍵是篩選出合適的菌種，要求菌種本

6、身及其分泌物對人畜安全無害，并能夠在蛋白質(zhì)底物上良好表達(dá)，菌種能分泌合適的蛋白酶在體外將蛋白質(zhì)切成長短合適的肽段?，F(xiàn)在生產(chǎn)上主要使用米曲霉、乳酸菌、芽孢桿菌等類能分泌蛋白酶的菌種，讓菌種分泌的蛋白酶酶解蛋白質(zhì)產(chǎn)生小肽蛋白，其肽產(chǎn)物的分子量分布大多在3000以上，其產(chǎn)品中的小肽以營養(yǎng)性小肽為主。但為了提高小肽的產(chǎn)量和品質(zhì)還應(yīng)注意底物的組成、菌齡、接種量、發(fā)酵時(shí)間等因素的影響。微生物發(fā)酵法的優(yōu)點(diǎn)是能較好地去除蛋白原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子和一些蛋白抗原成分，并且由于在微生物發(fā)酵過程中加入乳酸菌、酵母菌、米曲霉、芽孢桿菌等菌株，還可產(chǎn)生3%左右乳酸和發(fā)酵香味，具有酸化劑的作用，有利于提高動(dòng)物采食量，改善動(dòng)物

7、胃腸道的微環(huán)境的作用。 2.1.3 酸解法和堿解法 指在只有酸或堿存在的條件下使蛋白發(fā)生分解產(chǎn)生小肽的一種方法。由于堿水解時(shí)，絲氨酸、蘇氨酸等大部分氨基酸被破壞，且還會發(fā)生消旋作用，產(chǎn)生D 型和L 型氨基酸的混合物，營養(yǎng)成分損失大，因此，很少采用此法來制取肽類；但用酸水解蛋白質(zhì)則不會引起氨基酸的消旋作用，且水解速度快、反應(yīng)完全徹底。用酸水解法制備小肽存在的問題是溫度和時(shí)間對酸水解程度的影響，其中溫度的影響更大。并且所得水解產(chǎn)物中含大量因中和反應(yīng)而產(chǎn)生的鹽，若能除去其中的鹽并分離游離氨基酸，則小肽含量可大大提高?？偟膩碚f酸解法和堿解法多用于試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，而在生產(chǎn)實(shí)踐中使用較少。 2.2 化學(xué)合成法

8、化學(xué)合成法分為液相法和固相法。液相法不適合反應(yīng)中間體溶解度較低的情況。固相法是把要合成的多肽其中一端的氨基酸羧基、氨基或側(cè)鏈基附著在固體載體上，然后從氨基端或羧基端逐步增長肽鏈的方法。與液相法相比，固相法易于純化，并可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。但是由于成本高所以極大地限制了固相法的應(yīng)用。主要原因在于在肽鍵形成中，存在消旋作用因而需要保護(hù)和去保護(hù)操作，導(dǎo)致產(chǎn)率低。另一方面由于 需要用超過量的耦聯(lián)劑和?；噭?，并且回收這些組分相當(dāng)困難，所以也影響到了小肽的生產(chǎn)。2.3 酶合成法 酶合成法指用蛋白酶來催化合成肽。在活性肽的酶合成法中，最廣泛應(yīng)用的酶是絲氨酸和半胱氨酸內(nèi)切酶。酶法合成與其它合成方法相比具有： 在溫

9、和條件下進(jìn)行，危險(xiǎn)性相對較低；專一性強(qiáng)，取材廣泛；立體異構(gòu)和消旋作用。但其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用仍然有限，這主要是因?yàn)槊阜ê铣呻牡膽?yīng)用研究較少，沒有體現(xiàn)酶法合成的優(yōu)越性。 2.4 生物工程法 生物工程法指從動(dòng)物或植物的基因組中分離出帶有目的基因的DNA 片段，然后將此DNA片段克隆至適當(dāng)?shù)妮d體并采用特定方法將其導(dǎo)入受體細(xì)胞，通過細(xì)胞表達(dá)獲得所需要的活性肽或?qū)⑼庠椿虿迦氲绞删w基因序列之中，使得多肽以融合蛋白形式表達(dá)在噬菌體顆粒表面，并經(jīng)過加工、純化后來獲得所需要的小肽。雖然使用生物工程法只要建立起了一個(gè)適當(dāng)?shù)捏w系，就可以用廉價(jià)的原料通過發(fā)酵的方法來獲得大量活性肽，并且基因重組技術(shù)與其它方法相比有

10、其不可比擬的優(yōu)勢，但DNA 重組技術(shù)僅限于大肽的生產(chǎn)，而且其表達(dá)效率較低、產(chǎn)品提取和回收困難。此外，用DNA 重組技術(shù)構(gòu)建的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不能用于酰胺肽的生產(chǎn)，因?yàn)槲⑸锶狈?酰化酶，這限制了在生物活性表達(dá)方面起決定性作用的酰胺化的廣泛使用。而噬菌體展示肽庫技其缺點(diǎn)是庫容多樣性易受到多種因素的影響，且獲得的是小分子肽親和力較低。 3、肽產(chǎn)品苦味產(chǎn)生的原因 多肽的苦味是由其中的疏水性氨基酸引起，與蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)構(gòu)組成有關(guān)，多肽疏水度、氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)是重要的影響因素。一般天然蛋白質(zhì)的疏水性基團(tuán)都包含在分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部，從而不會呈現(xiàn)苦味。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解成小分子多肽時(shí)，就會曝露出其疏水性氨基酸殘基，此

11、類氨基酸殘基刺激味蕾，即呈現(xiàn)苦味。疏水度較大的氨基酸殘基有賴氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸等疏水性氨基酸殘基在多肽中的比例越高，則該多肽的苦味可能越強(qiáng)。疏水性氨基酸殘基位于C-端會導(dǎo)致苦加味強(qiáng)之外，還發(fā)現(xiàn)堿性氨基酸殘基也會加強(qiáng)多肽的苦味，另外苦肽的苦味還與特定的分子構(gòu)象相關(guān)，即多肽鏈兩端較近形成回轉(zhuǎn)構(gòu)象，時(shí)苦味更強(qiáng)。但當(dāng)相對分子質(zhì)量大于5000D的大豆多肽沒有苦味，相對分子質(zhì)量在5001000D的大豆多肽苦味最強(qiáng)。隨著分子質(zhì)量的減小，苦味逐漸減弱。 4、肽產(chǎn)品的苦味控制方法 肽產(chǎn)品的苦味控制方法主要包括以下幾種：加工工藝的改良及分離、提取、吸附、掩蓋、酶法及微生物脫苦等方法。4.1 加工工藝的

12、改良 在實(shí)際生產(chǎn)中所用的蛋白酶，都是非專一性內(nèi)切酶，其對蛋白原料的內(nèi)切酶解作用是隨機(jī)的。無論選用何種酶制劑和采用什么酶解條件蛋白酶對蛋白原料的酶解都會或多或少地產(chǎn)生游離氨基酸，并且隨著水解度的提高，蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸疏水性末端大量游離出小肽末端疏水性氨基酸殘基也不斷暴露，導(dǎo)致水解產(chǎn)物產(chǎn)生苦味。因而采用相同的酶解蛋白原料，不同的工藝和操作參數(shù)，將產(chǎn)生不同的酶解結(jié)果，將對小肽產(chǎn)品的品質(zhì)有很大的影響，特別是酶添加量，底物濃度，酶解溫度，酶解過程控制，酶解過程加堿(酸) 頻率及加堿(酸)總量等條件的控制。因而應(yīng)根據(jù)所要得到的小肽的種類和特性來研究酶的特性，選擇合適的酶，優(yōu)化生產(chǎn)工藝的各項(xiàng)參數(shù)從而避免了

13、酶解方法的盲目性，使產(chǎn)品中所希望得到的小肽含量較高，苦味值也能控制在較低水平，產(chǎn)品質(zhì)量也能夠得到保證。4.2 選擇性分離法 根據(jù)蛋白水解液中不同多肽成分的疏水性不同，利用活性炭、樹脂或溶劑，將水解液中疏水性高的多肽予以選擇性的去除。最早使用的除苦味方法是在小肽的酶解液中加入活性炭來進(jìn)行選擇性分離?；钚蕴渴且环N疏水性吸附劑，不僅可以除去水解液的不良風(fēng)味物質(zhì)和苦味成分，而且可除去大分子量的多肽、未水解的蛋白質(zhì)片斷和潛在的抗原性成分。但當(dāng)活性炭用量達(dá)到較大時(shí)，活性炭可吸附小肽和多種對氨基酸，因而產(chǎn)品得率較低，不利于小肽的生產(chǎn)。另外，利用活性炭處理后的成品，其苦味雖然有所降低但也帶來了活性炭的特殊氣味

14、。生產(chǎn)中還可以將酶解液經(jīng)過預(yù)處理后加入到瓊脂糖凝膠柱中，室溫洗脫，含疏水性氨基酸的苦味肽便結(jié)合于凝膠載體上，從而達(dá)到脫苦的目的，不過這種方法脫苦不夠徹底。 4.3 掩蓋劑掩蓋法 向含苦味的蛋白水解液中加入一些能掩蓋蛋白質(zhì)水解液苦味的物質(zhì)或其他疏水基團(tuán)包被劑掩蓋苦味來減輕苦味。一般情況下可以在蛋白水解液中直接甜味物質(zhì)或酸味物質(zhì)來改良肽產(chǎn)品中的苦味，這種方法成本較低，但感官評定顯示，產(chǎn)品甜味和酸味過后仍能品嘗到較濃的苦味。另一種方法是在蛋白質(zhì)水解過程中加入交聯(lián)淀粉，其主要機(jī)理在于交聯(lián)淀粉能將苦味基團(tuán)掩藏于淀粉的分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部，從而阻止它們接觸味蕾而起到掩蓋苦味的目的。要達(dá)到這種效果，必須加熱淀粉與苦

15、味肽的混合物?？辔峨倪€可以和濃縮乳清蛋白、脫脂奶混合，也有脫苦或掩苦作用，其原因則是是蛋白質(zhì)之間、氨基酸和肽之間存在親和作用。 4.4 酶脫苦法 酶脫苦法所使用的外切酶主要是指端肽酶，它是從肽鏈的一個(gè)末端開始將氨基酸水解下來發(fā)揮作用的，如果將其細(xì)分還可以再分為羧肽酶和氨肽酶，前者的作用從肽鏈的羧基末端開始一個(gè)個(gè)水解肽酶，而后者從氨基末端開始，端肽酶可以從肽鏈的末端移去一個(gè)或多個(gè)氨基酸分子，羧肽酶從C-端，氨肽酶從N-端起作用但外切酶所切下的氨基酸，其苦味閥值可能較低，甚至有可能是疏水性氨基酸，小肽蛋白中疏水性氨基酸可能再度暴露出來，增加苦味，因此這種方法的脫苦得不到有效保證，脫苦效果也不太明顯

16、。但是如果在脫苦工藝中添加風(fēng)味酶，除了能產(chǎn)生外切酶酶解的效應(yīng)，還產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，生成濃香味風(fēng)味物質(zhì)，產(chǎn)品苦味有較大緩和，對動(dòng)物采食有利，但脫苦成本較高。 4.5 微生物發(fā)酵法 一些微生物體內(nèi)存在一定的產(chǎn)肽酶體系，它們能將苦味肽進(jìn)一步水解，使苦味下降甚至完全脫除。例如用歐文氏菌細(xì)菌與胃蛋白酶水解的蛋白水解液作用，其脫苦效果十分顯著。同樣用乳酸菌和釀酒酵母水解雞肉蛋白酶解液中的苦味肽，發(fā)現(xiàn)苦味肽的苦味強(qiáng)度下降十分明顯，而且游離氨基酸的含量逐漸提高。同時(shí)由于此法中添加了有益微生物，故其發(fā)酵產(chǎn)物具有乳香味和酒香味等風(fēng)味物質(zhì)，并且產(chǎn)品的誘食性較好。 4.6 類蛋白反應(yīng)法 這種方法最早是由日本科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)，并且該反應(yīng)可以極大的脫除蛋白水解物的苦味。濃縮的蛋白水解物在適當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)蛋白酶作用就會形成凝膠狀的物質(zhì)，即發(fā)生“類蛋白反應(yīng)”，該反應(yīng)的進(jìn)行主要依賴于底物的種類、酶、底物濃度以及pH值。對于該反應(yīng)的機(jī)制，目前認(rèn)同較多的是轉(zhuǎn)肽作用的結(jié)果，通過轉(zhuǎn)多肽作用，疏水性氨基