不同取代度N,O-羧甲基殼聚糖的抗氧化性能

1、不同取代度N,O-羧甲基殼聚糖的抗氧化性能    殼聚糖是一種來(lái)源于甲殼類(lèi)動(dòng)物外殼的天然堿性多糖,因具有良好的生物相容性、可生物降解性等多種生物活性,在食品、生物醫(yī)學(xué)和化工等領(lǐng)域的研究中取得了重大進(jìn)展1-4。殼聚糖結(jié)構(gòu)單元中有-OH和-NH2,具有潛在的自由基清除活性,同時(shí)也決定了殼聚糖可進(jìn)行多功能基團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)。羧甲基殼聚糖是殼聚糖經(jīng)羧甲基化后的一類(lèi)殼聚糖衍生物。在眾多關(guān)于殼聚糖衍生物的研究中羧甲基殼聚糖的研究較早,也最令人注目5-7。根據(jù)羧甲基取代位置的不同,可以分為O-羧甲基殼聚糖、N-羧甲基殼聚糖和N,O-羧甲基殼聚糖。羧甲基在多糖主鏈上取代的位

2、置和程度都直接影響?hù)燃谆鶜ぞ厶堑母鞣N性能,是殼聚糖在生產(chǎn)、研究和應(yīng)用中的重要技術(shù)指標(biāo)。但是有關(guān)羧甲基殼聚糖的取代位置、取代度及其功能之間關(guān)系的研究,尚未見(jiàn)太多報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以低聚殼聚糖(Chitosan oligosaccharide,COS)為原料,制備了三種不同取代度的N,O-羧甲基殼聚糖,研究了其對(duì)超氧陰離子自由基O·-2、DP-PH自由基和過(guò)氧化氫(H2O2)的清除活性和還原能力,并初步探討了N,O-羧甲基殼聚糖取代度對(duì)其抗氧化活性的影響規(guī)律。1實(shí)驗(yàn)部分1.1材料低聚殼聚糖購(gòu)自浙江金殼生物化學(xué)有限公司(凝膠色譜測(cè)定其分子量為5000 Da);魯米諾、DP-PH購(gòu)自Sigma公司

3、;其余試劑均為分析純,購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司。1.2N,O-羧甲基殼聚糖的制備及表征將5 g殼聚糖加入到50mL 42%NaOH溶液中,充分溶脹之后轉(zhuǎn)至三口燒瓶中并加入50 mL異丙醇,共置30min后加入6 g的氯乙酸。升溫至60反應(yīng)3 h。冷卻后,溶液用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至中性,用無(wú)水乙醇沉淀,用95%的乙醇及無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌。將合成的產(chǎn)物于60真空干燥,即得到產(chǎn)物N,O-羧甲基殼聚糖A(NOA)。利用相同的實(shí)驗(yàn)方法,分別加入4和8 g氯乙酸制得產(chǎn)物N,O-羧甲基殼聚糖B和C(NOB和NOC)。紅外光譜在EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀上進(jìn)行,采用KBr壓片法制樣,測(cè)定波數(shù)范圍為50040

4、00 cm-1,分辨率為0. 8 cm-1。取代度通過(guò)電位滴定法測(cè)得8。1.3對(duì)超氧陰離子自由基O·-2的清除用pH 10. 20的0. 5 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制濃度為1. 5×10-3mol/L的魯米諾溶液,用1×10-3mol/L的鹽酸配制濃度為0. 1mol/L的鄰苯三酚儲(chǔ)備液,使用前用去離子水稀釋至1×10-4mol/L。以緩沖液作為溶劑,配制成不同濃度的樣品溶液。用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀依次測(cè)定從稀到濃的樣品溶液,讀出峰面積。清除率=(A0-Ai) /A0×100%。式中,A0為空白溶液峰面積,Ai為樣品

5、溶液峰面積。經(jīng)SOD,過(guò)氧化氫酶及甘露醇檢測(cè),該體系產(chǎn)生的自由基為超氧陰離子O·-25。1.4對(duì)DPPH自由基的清除在裝有2 mL的濃度為1×10-4mol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液的比色管中,加入不同濃度的樣品溶液2 mL,搖勻, 33避光靜置半小時(shí),在517 nm處測(cè)量吸光度Ai。用去離子水代替樣品溶液,得吸光度A0,無(wú)水乙醇代替DPPH,得吸光度Aj。清除率=1-(Ai-Aj) /A0×100%9。1.5對(duì)過(guò)氧化氫H2O2的清除以pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液配制濃度為8×10-4mol/L的H2O2溶液。取2 mL上述溶液加入2mL不同濃度的樣品

6、溶液,混合均勻,靜置10min,在230 nm處測(cè)量其吸光度Ai。用去離子水代替樣品溶液,得吸光度A0。去離子水代替H2O2磷酸鹽溶液,得Aj。清除率(% ) =1 -(Ai-Aj) /A0×100%。1.6還原能力的測(cè)定還原能力根據(jù)文獻(xiàn)10測(cè)定并稍做改進(jìn)。取2mL不同濃度的樣品,加入pH=6. 6的0. 2 mol/L磷酸緩沖液1%鐵氰化鉀溶液各2. 5 mL,混勻, 50水浴20 min后迅速冷卻,加入2. 5 mL 10%三氯乙酸溶液,混勻后在2000 r/min下離心10 min,取上清液2 mL,加入2. 5 mL去離子水和0. 5 mL 0. 1%的三氯化鐵溶液,靜置10

7、 min后在700 nm處測(cè)定吸光度。2結(jié)果與討論2.1紅外光譜及取代度圖1COS、NOA、NOB和NOC的紅外光譜Fig·1FTIR spectra ofCOS,NOA,NOB and NOC紅外光譜是結(jié)構(gòu)表征的有力工具,它能明確地提供基團(tuán)信息。醚化之后,衍生物NOA、NOB和NOC與原料低聚殼聚糖COS的結(jié)構(gòu)變化如圖1所示。所有樣品均在1100 cm-1附近有較強(qiáng)的多糖特征吸收峰。在NOA、NOB和NOC的紅外譜圖中,1420 cm-1附近出現(xiàn)了羧酸負(fù)離子-COO-的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰11。殼聚糖中1633、1560 cm-1處分別為酰胺帶和帶,在NOA,NOB和NOC中二峰重合

8、為1610 cm-1附近單峰,且強(qiáng)度增加,是-NH2羧甲基化的標(biāo)志。另外, 3400 cm-1-OH吸收峰明顯變窄,這是由于C6位上-OH發(fā)生了醚化反應(yīng),-OH減少而引起的。紅外圖譜表明,所合成產(chǎn)物均為N,O-羧甲基殼聚糖。用電位滴定法測(cè)得產(chǎn)物的總?cè)〈?DS),-NH2取代度(DSN)以及-OH取代度(DSO)的大小如圖1所示。由此可見(jiàn),產(chǎn)物的總?cè)〈入S著氯乙酸加入量的增多而升高。表1NOA、NOB和NOC的取代度Table 1Substituting degrees ofNOA,NOB and NOCDS DSNDSONOA 1. 25 0. 51 0. 74NOB 1. 13 0. 29

9、 0. 84NOC 1. 35 0. 38 0. 972.2對(duì)超氧陰離子O·-2的清除超氧陰離子O·-2是一種毒性很大的活性氧,對(duì)O·-2的清除是抗氧化能力評(píng)價(jià)的一個(gè)重要方面。圖2為不同取代度的N,O-羧甲基殼聚糖對(duì)O·-2的清除曲線(xiàn)。、和的清除活性均隨著濃度圖2NOA、NOB和NOC對(duì)超氧陰離子的清除ig·2Scavenging effects ofNOA,NOB and NOC on O·-2升高而逐漸增強(qiáng),其半抑制濃度( IC50)分別為·75、4. 96和6. 48 mg/mL。即對(duì)O·-2清除活性順為:N

10、OA>NOB>NOC。如表1所示,NOA、NOBNOC在-OH位置上的取代度分別為0. 74、0. 840. 97。結(jié)果表明,隨著-OH取代度的降低,N,O-甲基殼聚糖清除O·-2的能力逐漸增強(qiáng)。在殼聚糖-NH2和-OH是與自由基反應(yīng)活性有關(guān)的基團(tuán),隨DSO的升高,活性-OH數(shù)目下降,與O·-2反應(yīng)能下降,故在本體系中,-OH取代度最大的NOC清活性最弱。這也表明-OH在對(duì)O·-2的清除中起著關(guān)重要的作用。2.3對(duì)DPPH自由基的清除圖3NOA、NOB和NOC對(duì)DPPH自由基的清除Fig·3Scavenging effects ofNOA,N

11、OB andNOC onDP-PH radical圖3描述了不同取代度的N,O-羧甲基殼聚糖DPPH自由基的清除能力。當(dāng)濃度從0. 075增至0. 75 mg/mL時(shí),所有樣品對(duì)DPPH自由基的清除率濃度的上升而逐漸增大。之后隨著濃度的升高,OB對(duì)DPPH自由基的清除活性依然逐步上升,而OA的清除活性趨于平緩,NOC對(duì)DPPH自由基的除率反而開(kāi)始緩慢下降。由圖可知,NOA和NOB本體系中的IC50分別為0. 70、1. 44 mg/mL,而OC在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)未達(dá)到半抑制濃度。即抗化能力NOA>NOB>NOC。這一結(jié)果表明在DP-H體系中,N, O-羧甲基殼聚糖的清除活性隨-OH代

12、度的降低而增強(qiáng)。DPPH是一種相當(dāng)穩(wěn)定的自基,可接受氫或電子形成穩(wěn)定分子。而殼聚糖衍生物的活性-NH2和-OH是與DPPH反應(yīng)的活性基團(tuán)。故-OH取代度越低,活性-OH的數(shù)目越多,從而可以提供更多的氫,達(dá)到清除DPPH自由基的目的。2.4對(duì)過(guò)氧化氫H2O2的清除H2O2可引發(fā)細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)、破壞細(xì)胞膜;還能誘發(fā)細(xì)胞凋亡,促使DNA鏈斷裂,從而損傷細(xì)胞,參與多種病理機(jī)制。圖4描述了殼聚糖衍生物NOA、NOB和NOC清除H2O2的活性。當(dāng)試樣溶液的濃度增大,樣品的清除H2O2的活性也隨之逐漸增加。由圖可知,樣品清除H2O2的活性大小順序?yàn)?NOB>NOC>NOA。

13、結(jié)果表明:在H2O2體系中,隨著-NH2取代度的降低,N,O-羧甲基殼聚糖清除H2O2的能力增強(qiáng)。在本體系中,-NH2取代度降低,意味著保留活性-NH2的數(shù)目增多,從而清除H2O2的能力增強(qiáng)。這一結(jié)果也表明活性-NH2在清除H2O2過(guò)程中的重要性。圖4NOA、NOB和NOC對(duì)H2O2的清除Fig·4Scavenging effects ofNOA,NOB and NOC onH2O22.5還原能力的測(cè)定還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)。研究表明抗氧化活性和還原能力之間存在著一定的關(guān)系12。NOA、NOB和NOC的還原性如圖5所示。隨著濃度的增加,各樣品的吸光值隨之增加,

14、還原能力逐漸增強(qiáng)。在2 mg/mL時(shí), NOA、NOB和NOC的吸光度分別是0. 924、0. 637和1·069。在此體系中,樣品的還原能力大小順序?yàn)?NOC>NOA >NOB。如表1所示, NOA、NOB和NOC的總?cè)〈确謩e為1. 25、1. 13和1. 35,即DSNOC>DSNOA>DSNOB。結(jié)果表明:隨著總?cè)〈仍黾?N,O-羧甲基殼聚糖的還原能力隨之增強(qiáng)。圖5NOA、NOB和NOC的還原能力Fig·5Reducing power ofNOA,NOB and NOC這可能是因?yàn)榭側(cè)〈仍礁?給電子基團(tuán)-CH2COO-引入越多,從而增加了

15、活性-NH2和-OH位置的電子云密度,給電子能力增強(qiáng),從而還原能力增強(qiáng)。3結(jié)論殼聚糖及其衍生物的抗氧化活性與其活性-NH2和-OH的數(shù)目密切相關(guān)。殼聚糖具有多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn),其羧甲基化過(guò)程中,會(huì)因反應(yīng)條件不同而得到取代位點(diǎn)不同的羧甲基殼聚糖。為了探討?hù)燃谆鶜ぞ厶堑目寡趸耘cN-取代和O-取代的關(guān)系,我們?cè)芯苛薕-羧甲基殼聚糖的抗氧化活性,結(jié)果表明:隨著取代度(OA>OB>OC)的增加,O-羧甲基殼聚糖清除超氧陰離子的活性增強(qiáng);而清除過(guò)氧化氫的活性以及還原能力的強(qiáng)弱順序?yàn)?OB>OA>OC13。考慮到N,O-羧甲基殼聚糖的一些特殊用處,如可以作為高級(jí)化妝品添加劑、重金屬螯合劑、藥物緩釋劑、植物生長(zhǎng)劑和工業(yè)廢水處理劑等。我們希望研究不同取代度的N,O-羧甲基殼聚糖的抗氧化性,以期更好地?cái)U(kuò)大其應(yīng)用范圍或使其具有多種功能性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)控制氯乙酸的加入量,制