線蟲RNA干擾的基因沉默

1、線蟲RNA干擾的基因沉默一、實(shí)驗(yàn)背景及目的1、 RNA干擾（RNAi）是一種使基因使失活的有效方法，在線蟲中，RNA干擾因?yàn)楹?jiǎn)單快速成為研究基因功能的有效手段。2、 秀麗線蟲是一種生活在土壤中的線蟲，長(zhǎng)約1mm，直徑70um，由959個(gè)細(xì)胞組成。它具有生活周期短、易培養(yǎng)和保存等優(yōu)點(diǎn)。秀麗線蟲具有雌雄同體和雄性個(gè)體兩種性別。雌雄同體的線蟲有兩條X染色體和5對(duì)常染色體。其基因組大小為80Mb，包含13000個(gè)基因。秀麗線蟲在20時(shí)生活周期為3.5天，25時(shí)約為3天，15時(shí)約為6天。受精卵經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生孵化出L1、L2、 L3 、L4，最后成為成熟的幼蟲。當(dāng)食物缺乏或群體密度過(guò)大等環(huán)境不良的條件時(shí)，L

2、2會(huì)不進(jìn)入L3而成為dauer幼蟲來(lái)抵御不良環(huán)境，當(dāng)環(huán)境恢復(fù)后dauer幼蟲不經(jīng)過(guò)L3直接進(jìn)入L4。因此可以利用該特性保存線蟲品系。3、 RNAi是一種基因knock down 技術(shù)，將體外合成的含有目的基因的dsRNA通過(guò)某種方式引入到線蟲體內(nèi)，導(dǎo)致其體內(nèi)相應(yīng)的目的基因mRNA降解，從而達(dá)到基因沉默的目的。通過(guò)顯微注射dsRNA或者把線蟲浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能夠表達(dá)dsRNA的大腸桿菌喂食線蟲，可以將dsRNA導(dǎo)入大腸桿菌中。在大腸桿菌HT115中，含有目的基因發(fā)夾結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，在IPTG的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄出正義和反義的RNA,兩條RNA鏈通過(guò)退火形成dsRNA。當(dāng)線蟲以此大腸桿菌為

3、食時(shí)，他們就攝取了大腸桿菌合成的dsRNA，并觸發(fā)了線蟲體內(nèi)RNA干擾的發(fā)生。4、 本實(shí)驗(yàn)將利用表達(dá)tag-214dsRNA大腸桿菌喂食線蟲來(lái)介導(dǎo)RNAi，以達(dá)到鑒定tag-214基因功能以及觀察實(shí)驗(yàn)效果的目的。2、 實(shí)驗(yàn)材料及試劑1、材料： 1） 秀麗線蟲（C.elegans）rrf-3突變體（RNAi敏感型） 2） 大腸桿菌（E.coli）野生型菌株OP50 3） 帶有tag-214發(fā)夾結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的HT115菌株。2、試劑： 1） NGM普通固體培養(yǎng)基 2）含有Amp+和IPTG的NGM固體培養(yǎng)基（用于RNAi） 3）LB培養(yǎng)基 4）M9緩沖液3、 實(shí)驗(yàn)操作 由于此次試驗(yàn)培養(yǎng)基配制以及大腸桿

4、菌培養(yǎng)等的前期過(guò)程是由兩個(gè)大組分別進(jìn)行的，我詢問(wèn)了第二大組的實(shí)驗(yàn)相關(guān)步驟，但還是會(huì)有紕漏，所以有些實(shí)驗(yàn)過(guò)程和實(shí)際的操作會(huì)有差錯(cuò)，有些細(xì)節(jié)也會(huì)省略。1、配制NGM固體平板，M9緩沖液，LB培養(yǎng)基具體配制所需要的成分和用量在實(shí)驗(yàn)書上均有，需要在比例和一些操作上多加注意。1） NGM普通固體平板每組需要配制500ml（實(shí)際上配少了），其中的細(xì)菌蛋白胨為peptone。膽固醇以及磷酸鉀緩沖液要在其他組分混合并且高溫滅菌之后加入，統(tǒng)一倒平板，放置20h左右至表面干燥。2） LB培養(yǎng)基中的胰蛋白酶凍是typtone，我們每組配制了500ml，121高壓蒸汽滅菌。3） Amp+為200mg/l tet+為1

5、00mg/l IPTG為1Mm ,均需要抽濾之后放入離心管中。4）第二大組配制LB培養(yǎng)基（Amp+ tet+）NGM固體平板（Amp+）IPTG濃度為4mM。2、 大腸桿菌的培養(yǎng)1） 在NGM普通固體平板上劃線培養(yǎng)大腸桿菌OP502） 在NGM固體平板（Amp+ tet+）上劃線培養(yǎng)大腸桿菌HT115(對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)3、 大腸桿菌的活化1） 大腸桿菌OP50的活化：挑取少量的大腸桿菌OP50到LB普通液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)20h。之后鋪到NGM普通固體平板。2） 大腸桿菌HT115的活化：挑取少量的大腸桿菌HT115(對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)到LB培養(yǎng)基（Amp+ tet+）中，37振蕩培養(yǎng)20

6、h。3） 大腸桿菌HT115的再活化：吸取1mL的大腸桿菌HT115(對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)到LB培養(yǎng)基（Amp+ tet-）中，37振蕩培養(yǎng)20h。之后鋪到NGM固體平板（Amp+ tet+）上。4、 rrf-3突變體的培養(yǎng)：將線蟲rrf-3突變體接種到含有大腸桿菌OP50的NGM普通固體平板上，20培養(yǎng)。5、 線蟲擴(kuò)繁（用到chunck）選擇線蟲rrf-3突變體培養(yǎng)基中未受到污染而且線蟲長(zhǎng)勢(shì)較好的部分切下一小塊(手術(shù)刀蘸酒精，酒精燈燒，重復(fù)三次)，接到大腸桿菌OP50的NGM普通固體平板上。20培養(yǎng)（由于線蟲長(zhǎng)勢(shì)問(wèn)題，培養(yǎng)了接近三天）6、 線蟲生長(zhǎng)周期的同步化1） 取3mL的M9緩沖液加入到線蟲

7、rrf-3突變體的NGM普通固體平板，反復(fù)輕輕地晃動(dòng)平板，將平板上的線蟲沖洗下來(lái)，然后將含有線蟲的M9緩沖液轉(zhuǎn)移到15mL的離心管中。2） 向離心管加入2mL的Naclo溶液和1mLNaOH(5mol/L)溶液，之后馬上蓋緊蓋子劇烈晃動(dòng)離心管。當(dāng)發(fā)現(xiàn)溶液中的線蟲身體呈現(xiàn)彎曲狀，并且還沒有出現(xiàn)絮狀物時(shí)，加入M9緩沖液至15mL以終止反應(yīng)。3000r/min離心1min。3） 棄上清，加M9緩沖液至15mL，3000r/min離心1min，重復(fù)。4） 棄上清，小心吹打沉淀，并將沉淀滴入未鋪菌的NGM普通固體培養(yǎng)皿中央，20培養(yǎng)16-20小時(shí)。7、 收獲L1幼蟲及chunck1) 培養(yǎng)16-20h后

8、，NGM平板上的線蟲發(fā)育成L1幼蟲。取500uL的M9緩沖液沖洗平板中的線蟲，并將沖洗下的L1幼蟲放到1.5mL的離心管中。將L1幼蟲平均分為兩份，分別接到大腸桿菌HT115(對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)的平板中。20培養(yǎng)。2) 將培養(yǎng)線蟲的培養(yǎng)基選擇無(wú)污染且線蟲長(zhǎng)勢(shì)較好的部分切下來(lái)一小塊，接到OP50平板上，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別接1個(gè)大板，普通的小板兩個(gè)（培養(yǎng)線蟲留著做后續(xù)的實(shí)驗(yàn)的）。8、 Single worm（挑單個(gè)蟲）睫毛依次蘸取Naclo 、70%乙醇、無(wú)菌水/M9緩沖液，在顯微鏡下分別挑取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的線蟲，分別放在兩個(gè)含有OP50的NGM固體培養(yǎng)板上，每個(gè)平板里兩只線蟲（我們有的平板里會(huì)多挑

9、取一只）。9、 觀察RNAi的表型和效率第二天在顯微鏡下觀察并且對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平板內(nèi)的卵進(jìn)行計(jì)數(shù)。4、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果這是我們計(jì)數(shù)得到的結(jié)果對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 1212蟲卵數(shù)358131 接蟲數(shù)2322蟲卵數(shù)/接蟲數(shù)17.5271.50.5我將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的蟲卵數(shù)/接蟲數(shù)取了平均值，并運(yùn)用EXCEL做成了柱狀圖進(jìn)行明顯的比較。5、 結(jié)果分析從數(shù)據(jù)以及圖標(biāo)結(jié)果看來(lái)，對(duì)照組平均產(chǎn)卵比例遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)卵比例，說(shuō)明tag-214基因有控制線蟲產(chǎn)卵的功能，當(dāng)這種基因被沉默掉后，線蟲的產(chǎn)卵率明顯下降，另一方面也說(shuō)明此次的RNA干擾實(shí)驗(yàn)做的比較成功，得到了與理論相一致的結(jié)果。但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們也出現(xiàn)了一些問(wèn)

10、題，包括有平板的雜菌污染，最后得到的去做RT-PCR的菌也較少，所以，在下面，主要對(duì)這些細(xì)節(jié)錯(cuò)誤以及過(guò)程中的注意事項(xiàng)進(jìn)行分析：1、 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程過(guò)需要配制的試劑以及其它溶液要根據(jù)配方和用量，按照一定比例配，在秉著不浪費(fèi)的前提下可以多配制一些，以備不時(shí)之需。2、 在對(duì)大腸桿菌或者線蟲進(jìn)行培養(yǎng)或者操作的時(shí)候，一定要在超凈臺(tái)，而且不要通過(guò)其他方式造成污染。在后面chunck的時(shí)候，由于好多平板上都被污染，干凈的平板已經(jīng)不夠了，所以我們最后缺少的平板只能挑選污染最小用，這也給我們后來(lái)的實(shí)驗(yàn)造成了很大的干擾，因?yàn)槲廴静]有排除，而是越來(lái)越重，導(dǎo)致培養(yǎng)的線蟲不能用。3、 沖洗L1幼蟲并分板培養(yǎng)的時(shí)候，盡量把

11、幼蟲的量平分，否則有的板長(zhǎng)出來(lái)的蟲多，有的少，而我們蟲多的平板被污染了，所以后面RT-PCR的線蟲是使用老師提供的線蟲進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。4、 在挑取線蟲的時(shí)候，睫毛要按照順序依次蘸取Naclo 、70%乙醇、無(wú)菌水/M9緩沖液，順序不要錯(cuò)也不要落下，最后在計(jì)數(shù)的時(shí)候可以選擇在平板表面進(jìn)行十字劃線計(jì)數(shù)法，這樣計(jì)數(shù)可以簡(jiǎn)單方便一些。 RNA的提取、鑒定以及RT-PCR1、 實(shí)驗(yàn)背景1、 RNA的制備是通過(guò)cDNA途徑克隆目的基因，了解基因在不同的組織或細(xì)胞中的表達(dá)水平，以及研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等必不可少的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。RT-PCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈擴(kuò)增相結(jié)合的技術(shù)。2、 本次試驗(yàn)利用Triz

12、ol法提取RNA ，Trizol的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可以裂解細(xì)胞，促進(jìn)核蛋白體的解離，并將RNA釋放到溶液中；苯酚會(huì)使蛋白質(zhì)變性，加入氯仿后可抽提苯酚，促使RNA進(jìn)入水相。3、 RNA是一類極易被降解的分子，因此要得到完整的RNA必須要最大限度的抑制提取過(guò)程中內(nèi)源或者外源的RNA酶活性。提純得到的RNA可以使用非變性和變性凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。非變性RNA凝膠電泳可避免使用有毒的物品，但是由于RNA分子相互作用形成大量的雙鏈結(jié)構(gòu)，故無(wú)法判斷RNA的相對(duì)分子質(zhì)量。在完全變性的條件下，RNA分子完全伸展，其電泳遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測(cè)定RNA分子相對(duì)分子質(zhì)

13、量時(shí)，一定要用變性凝膠。4、 在總RNA分子中以rRNA最多，占80%-85%，完整為降解的RNA分子的電泳圖譜可以清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三條帶。如果28s和18s條帶明亮，條帶邊緣清晰，且28s條帶的亮度是18s條帶的兩倍以上，則認(rèn)為RNA沒有被降解。經(jīng)過(guò)鑒定未降解的RNA分子可通過(guò)RT-PCR反應(yīng)對(duì)某一特定的基因進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)由兩部分組成，首先是以RNA為模板合成cDNA，然后以cDNA為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增目的片段。用于逆轉(zhuǎn)錄的引物有隨機(jī)引物、Oligo dT以及基因特異性引物。Oligo dT適合具有polyA尾巴的RNA，不能用于原核生物的

14、RNA，真核生物的rRNA 和 tRNA等。5、 本實(shí)驗(yàn)的目的是以線蟲為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增線蟲的acting 基因的片段，學(xué)習(xí)并掌握RNA提取和鑒定，以及RT-PCR反應(yīng)的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2、 實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、 實(shí)驗(yàn)材料：秀麗隱桿線蟲野生型N22、 實(shí)驗(yàn)試劑：Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇、瓊脂糖、DNA上樣緩沖液、RT試劑盒，Premix Tap酶。3、 實(shí)驗(yàn)操作1） RNA分子的提取1、2 mL M9溶液 1500 r/min，離心1 min收集線蟲；將蟲體轉(zhuǎn)移到無(wú)RNA酶的研缽中，加入液氮研磨。其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。2. 收集

15、研磨的粉末，按50100 mg組織/mL Trizol 加入Trizol，室溫靜置5 min。3. 12,000 r/min 4 離心10 min。4. 小心吸取上清液，移入新的離心管中（切勿吸取沉淀)。5. 加入氯仿（200 µl氯仿/mL Trizol），蓋緊管蓋，用力震蕩15秒，再室溫靜置3 min。6. 12,000 r/min 4離心10 min。7. 從離心機(jī)中小心取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中。8. 向上清中加入異丙醇（500 µL異丙醇/mL Trizol)，上下顛倒充分混勻后，室溫靜置10 min。9. 12,000 r/min 4離心10

16、min。10. 小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75的乙醇l mL，輕輕上下顛倒離心管，12,000 r/min 4離心5 min后，小心棄去乙醇。11. 室溫干燥沉淀25 min后，加入適量的RNase-free水溶解沉淀。12. 待RNA沉淀完全溶解后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。2） 通過(guò)甲醛變性凝膠電泳鑒定提取的RNA這一部分是老師為我們完成的，具體的操作步驟就是按照ppt上的來(lái)看的。1.將電泳槽和制膠用具在0.3% H2O2中浸泡30 min，取出后用DEPC水沖洗并晾干。然后用75%乙醇沖冼一遍，晾干備用。2配制瓊脂糖凝膠：（1）稱取0.5 g瓊脂糖，置干凈的100 mL錐形瓶中，加入3

17、6 mL DEPC水，微波爐內(nèi)加熱使瓊脂糖徹底溶化均勻。（2）膠冷卻至6070 后，依次向其中加入9 mL甲醛、5 mL 10MOPS緩沖液和3 L溴化乙錠（1g/L），混合均勻。（3） 倒入已放置好梳齒的膠板內(nèi)，于室溫放置30 min以上使凝膠凝固。凝膠凝固后，小心取出梳齒，將膠放入電泳槽中，加入1×MOPS 緩沖液使凝膠剛好浸沒。3樣品準(zhǔn)備：（1） 取DEPC處理過(guò)的500 L小離心管，依次加入10×MOPS緩沖液2 L、甲醛3.5 L、甲酰胺（去離子）10 L、RNA 樣品4.5 L，混勻。（2）將離心管置于60 水浴中保溫10 min，再置冰上2 min。（3）向管

18、中加入3 L上樣緩沖液，混勻。4上樣：將上述處理好的樣品依次加入凝膠的各加樣孔中。5電泳：將樣品加入加樣孔后，以34 V/cm電壓降電泳，當(dāng)溴酚蘭移動(dòng)到膠的3/4處停止電泳。 6檢測(cè)和分析：電泳結(jié)束后，在紫外燈下檢查結(jié)果。3） RT-PCR反應(yīng)1. 逆轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)（1）取3 µg RNA ，2µgOligo dT至eppendorf 管中，70 10 min，高速離心5 sec 后置于冰上，目的是打開RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)；（2）按下列順序在一新管中加入以下試劑（20 µL體系）： MgCl2（25mmol/L） 2.4 µL 5× Reverse

19、Transcription buffer 4 .0µL dNTP mixture（10 mmmol/L） 1.0µL Recombinant RNasin RibonuClease inhibitor 1.0µL AMV Reverse Transcriptase 25 U/µL 0.6 µL（15 U） RNA 1 µg 用RNase-free ddH2O補(bǔ)足至20 µL（3） 反應(yīng)過(guò)程：25 5min ,42 1h ,70 15min ,4放置繼續(xù)或者20保存。2. PCR反應(yīng)（反應(yīng)體系為25uL） Premix Ex

20、Taq 12.5 µL Sense引物 (10 µM) 1 µL Antisense 引物(10 µM) 1 µL cDNA 5uL(稀釋5倍) 用ddH2O補(bǔ)足體積至25 µL PCR反應(yīng)條件為： 94 1 min 94 30 sec 55 1 min 72 30 sec（從94 30 sec至此步驟重復(fù)30次） 72 5min3. DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要是根據(jù)RNA和DNA電泳結(jié)果來(lái)判斷成功與否的。所以在接下來(lái)附上電泳結(jié)果。電泳結(jié)果圖：1、 RNA甲醛變性凝膠電泳鑒定圖2

21、、 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖5、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1） RNA甲醛變性凝膠電泳鑒定圖 在電泳圖中與MAKER條帶對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)三條條帶，由遠(yuǎn)及近分別為18srRNA、18srRNA、5srRNA。其中，5srRNA含量少，所以條帶較暗，很不清楚；18srRNA、28srRNA條帶均很亮，條帶邊緣比較清晰，而且28srRNA條帶的亮度可以達(dá)到18srRNA條帶亮度的2倍，說(shuō)明我們組提取的RNA沒有被降解。但是在上樣孔處有一條暗暗的條帶，查閱資料說(shuō)，上樣孔處如果有條帶，說(shuō)明有DNA污染。整個(gè)組基本上都存在或明或暗的條帶，但是從后面的結(jié)果來(lái)看，其他大多數(shù)組都沒什么影響，只有我們組出現(xiàn)了一條雜帶，所以，我

22、認(rèn)為，少量的DNA污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小。不過(guò)，不能排除影響的存在，所以在RNA沉淀以及沉淀分離的過(guò)程中一定要多加注意，要把上清棄的干凈些，否則稍有的才能留可能會(huì)造成很大的影響。2） DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖 我們是第一大組第四小組，從最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，我們組確實(shí)獲取到了RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到了cDNA,因此也在PCR之后擴(kuò)增得到了Acting 的基因片段。但是，唯一的缺憾是，我們的電泳條帶中竟然多出了一條較清晰明亮的雜帶，第3小組也有，但是亮度很暗，我也看了第二大組的結(jié)果，未出現(xiàn)相同的狀況。通過(guò)在網(wǎng)上查閱資料，分析在該過(guò)程中出現(xiàn)雜帶的原因：1、內(nèi)參引物的特異性不好，可能是非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致。2、反轉(zhuǎn)的cDNA里面含有較多的基因組DNA，可能是RNA提取質(zhì)量不到位導(dǎo)致，碰巧這對(duì)內(nèi)參引物橫跨了內(nèi)含子，從而導(dǎo)致PCR出現(xiàn)2條帶。加上之前RNA 點(diǎn)用的結(jié)果，整體分析，我覺得出現(xiàn)雜帶的原因是之前RNA提取的不到位，含有少量的DNA ，在整個(gè)過(guò)程中，大家