淺談卡維地洛抗動脈粥樣硬化作用的研究

1、淺談卡維地洛抗動脈粥樣硬化作用的研究         【摘要】  目的 探討卡維地洛在動脈粥樣硬化病變中的抗氧化作用及其對增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）及核因子kappaBp65（NFBp65）活化的影響。方法 雄性新西蘭大耳白兔24只，隨機(jī)分為正常組、高脂組、卡維地洛組，每組8只，共計(jì)喂養(yǎng)10周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，酶法檢測各組家兔的血清三酰甘油及膽固醇，黃嘌呤氧化法檢測血清超氧化物歧化酶（SOD），硫代巴比妥酸比色法檢測丙二醛（MDA）,并采用免疫組化的方法測定血管壁PCNA及NFBp65的表達(dá)。結(jié)果 高脂組和卡

2、維地洛組血清三酰甘油和膽固醇較正常組明顯升高（F=146.25、287.83,q=14.7620.75,P0.01），而該兩組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.53、0.59,P0.05）。高脂組較正常組SOD明顯降低，MDA明顯增加，而卡維地洛組較高脂組SOD有所升高，MDA有所降低（F=21.65、75.64,q=4.9824.29,P0.01）。高脂組PCNA和NFBp65的表達(dá)較正常組明顯增加，卡維地洛組PCNA和NFBp65的表達(dá)較高脂組明顯減少（F=426.12、521.38,q=56.1575.87,P0.01）。PCNA和NFBp65的呈正相關(guān)（r=0.975，P0.01）。結(jié)論 卡

3、維地洛有減輕脂質(zhì)過氧化損傷的作用，可阻斷NFB的活化，進(jìn)而抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。  【關(guān)鍵詞】  動脈硬化 卡維地洛 抗氧化劑 細(xì)胞增殖 兔 ABSTRACTObjectiveTo study the effect of carvedilol on antioxidation and activation of PCAN and NFB on atherosclerosis.MethodsTwentyfour male New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups: normal grou

4、p, highfat diet group and cavediloltreated group, with eight rabbits in each group. All the rabbits were fed for 10 weeks. After completion of the experiment, the levels of serum triglyceride and cholesterol were measured by enzymatic method, of serum SOD by xanthine oxidative technique, and of seru

5、m MDA by thiobarbituric acid method. Expression of the PCAN and NFBp65 in the vascular wall was detected immunohistochemically. ResultsCompared with those of normal rabbits, the levels of serum triglyceride and cholesterol of the highfat diet and cavediloltreated were extremely high （F=146.25，287.83

6、； q=14.76-20.75； P0.01), but no statistical difference was found between the latter two groups （q=0.53，0.59; P0.05). Lowlevel serum SOD and highlevel serum MDA were noticed in highfat diet rabbits. In highfat diet group, SOD was lower than that in normal group, and MDA was higher; in cavediloltreate

7、d group, SOD was higher, and MDA was lower as compared with normal group （F=21.65，75.64; q=4.98-24.29; P0.01）. The expression of PCNA and NFBp65 in highfat diet group was markedly increased as compared with the normal group; but the expression was decreased in carvedilol group as compared with highf

8、at diet （F=426.12，521.38; q=56.15-75.87； P0.01）. An analysis showed that a positive correlation existed between PCNA and NFBp65.  Conclusion Carvedilol might relieve the lipid peroxidation injury and block NFB activation so as to inhibit the proliferation of smooth muscle cells.    KE

9、Y WORDS atherosclerosis; carvedilol; antioxidants; cell proliferation; rabbits    動脈粥樣硬化(AS)是許多心腦血管疾病的基礎(chǔ)性病理表現(xiàn),也是中老年人常見疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。氧化損傷是AS病變過程中核心環(huán)節(jié)，而平滑肌細(xì)胞的遷移增殖是斑塊形成、管腔狹窄的直接原因?？ňS地洛是具有多種藥理活性的第三代受體阻滯劑，除具有非選擇性受體阻滯作用外，還有1受體阻斷作用。近年來的研究表明，卡維地洛具有較強(qiáng)的抗氧化作用，這使其在抗AS病變中具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食加免疫損傷內(nèi)皮的方法誘發(fā)家兔

10、AS模型，觀察卡維地洛對AS病變過程中脂質(zhì)過氧化損傷、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）及核因子kappaBp65（NFBp65）表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡述其抗AS作用機(jī)制，從而為臨床治療AS提供依據(jù)。    1  材料與方法      1.1  藥物和試劑    卡維地洛（金洛）由齊魯制藥有限公司提供，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20000100；超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；PCNA和NFBp65及相關(guān)SP試劑盒購自武漢博士德生物工程研究所。   

11、; 1.2  主要儀器    上海精密儀器廠721型分光光度計(jì)，美國Lambert公司石蠟切片機(jī)，日本Olympus公司顯微照相裝置，德國歐波同公司VIDAS 21圖像分析系統(tǒng)。    1.3  實(shí)驗(yàn)動物分組    健康雄性新西蘭大耳白兔24只（購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部，合格證號：醫(yī)動字第19025號），體質(zhì)量（2.50±0.25）kg，分籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分為正常組、高脂組、卡維地洛組，每組8只。    1.4  模型的制備及藥物干預(yù)    家兔

12、適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，高脂組和卡維地洛組均一次性經(jīng)耳緣靜脈注射牛血清清蛋白250 mg/kg，然后均行高脂飲食。高脂飼料配方為：1 g膽固醇+5 g豬油+94 g普通飼料。另外，卡維地洛組每日清晨行卡維地洛10 mg/kg灌胃。正常組行普通飼料喂養(yǎng)（100 mg/d）。各組家兔共喂養(yǎng)10周。    1.5  血液標(biāo)本的采集及測定    喂養(yǎng)10周后，各組動物分別行250 g/L烏拉坦（4 mL/kg）腹腔麻醉，沿胸骨正中線縱向剖開胸腔暴露心臟，直視下行右心室穿刺抽血，酶法檢測各組家兔的血清三酰甘油及膽固醇，黃嘌呤氧化法檢測血清SOD，硫代巴比妥酸比

13、色法檢測MDA，各操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。    1.6  局部病理標(biāo)本的取材及檢測    全血采集完畢后氣胸處死動物，游離主動脈至髂總動脈分叉處，仔細(xì)清除血管壁脂肪及結(jié)締組織，縱向剖開血管壁暴露內(nèi)膜表面，鋪平。高脂組、卡維地洛組在主動脈弓病變處取材，大小約1.0 cm×0.5 cm，正常組亦在主動脈弓處取材，其大小也約1.0 cm×0.5 cm，分別放入100 g/L中性多聚甲醛中固定，并逐步脫水，透明，浸蠟，包埋制成蠟塊。每一標(biāo)本連續(xù)切片兩張，分別行PCNA及NFBp65免疫組化檢測，免疫組化采用SP法，DAB顯色，操

14、作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。    PCNA及NFBp65陽性表達(dá)主要在細(xì)胞核內(nèi)，VIDAS 21計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測定一定面積陽性信號值和陽性信號平均吸光度，并計(jì)算二者乘積，即積分吸光度。測定時每一病理切片在高倍鏡下隨機(jī)取10個視野，取其平均值。    1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析    數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS 11.5進(jìn)行方差分析，變量間相關(guān)性檢驗(yàn)采用直線相關(guān)分析。    2  結(jié)   果    2.1  各組三酰甘油和膽固醇水平比較 &

15、#160;  高脂組、卡維地洛組血清三酰甘油及膽固醇水平均明顯高于正常對照組（F=146.25、287.83,q=14.7620.75,P0.01），而兩組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.53、0.59,P0.05）。見表1。    2.2  各組血清SOD活性和MDA含量比較    高脂組SOD活性較正常組明顯降低，MDA明顯增加，而卡維地洛組SOD較高脂組則有所升高，MDA有所降低，差別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.65、75.64,q=4.9824.29,P0.01）。見表2。    2.3  免疫組化

16、檢測結(jié)果    PCNA和NFBp65陽性染色定位于細(xì)胞核，染成棕褐色，正常組陽性著色很少見。高脂組PCNA和NFBp65陽性染色主要分布在內(nèi)膜及中膜靠近內(nèi)膜處，較正常組和卡維地洛組明顯增多，差別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=426.12、521.38,q=56.1575.87,P0.01）。見表3。相關(guān)分析結(jié)果，PCNA與NFBp65呈正相關(guān)（r=0.975，P0.01）。表1  各組家兔血脂水平比較表2  各組家兔血清SOD及MDA水平比較表3  各組家兔主動脈血管壁PCNA及NFBp65半定量結(jié)果比較    

17、0;         3  討   論    AS為一較為復(fù)雜的病理學(xué)進(jìn)程，其核心機(jī)制為脂質(zhì)過氧化損傷血管壁，而平滑肌細(xì)胞的遷移增殖是斑塊形成、管腔狹窄的直接原因?？ňS地洛具有明顯的抗氧化效應(yīng)，因此在抑制AS病變的過程中發(fā)揮重要的作用。    3.1  卡維地洛對血脂及脂質(zhì)過氧化的影響    AS病變形成的一個常見原因即為高脂血癥，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，卡維地洛對血三酰甘油及膽固醇無明顯影響，說明其抗AS作用不是通過影響血脂代謝而實(shí)現(xiàn)的

18、。SOD與MDA是反映AS進(jìn)展過程中氧化損傷的可靠指標(biāo)。SOD是體內(nèi)維持氧自由基產(chǎn)生與滅活的主要酶類，是清除氧自由基的“清道夫”；MDA是脂質(zhì)過氧化生成的一種醛基，AS時其在血液中含量直接反映出氧化損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，AS病變過程中存在脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，而卡維地洛具有明顯的抗氧化效應(yīng)。目前的研究表明，卡維地洛抗氧化作用的活性部位為其分子結(jié)構(gòu)上的咔唑基，其抗氧化作用的機(jī)制主要表現(xiàn)為：抑制內(nèi)源性抗氧化劑Vit E和谷胱甘肽的清除；與細(xì)胞膜上的Fe3+螯合，從而阻止由DHF/Fe3+ADP和Fe/Vit C介導(dǎo)的氧自由基產(chǎn)生及其所致細(xì)胞膜上LDL氧化1；作用于膜磷脂，降低膜對自由基的親和性

19、,并能鑲嵌在脂質(zhì)雙層膜較深的位點(diǎn)上，使咔唑基接近脂質(zhì)氧化的非飽和脂肪酸側(cè)鏈的位點(diǎn),從而發(fā)揮其抗氧化作用。此外，卡維地洛的代謝產(chǎn)物（SB211475和SB209995）抗氧化作用是卡維地洛的3080倍,是Vit E的1 00010 000倍2。    3.2  卡維地洛對PCNA和NFBp65表達(dá)的影響    PCNA又稱周期素,主要表達(dá)于處在增殖狀態(tài)的細(xì)胞。細(xì)胞周期受控于PCNA,它作為生長因子的感受器,與周期蛋白依賴性激酶結(jié)合為外源信號的整合器,誘導(dǎo)蛋白磷酸化,從而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程3。NFB是將信息從胞漿傳至胞核引起相應(yīng)基因表達(dá)的重要的轉(zhuǎn)錄因

20、子，它是由多肽鏈p65和p50蛋白亞基構(gòu)成的二聚體,包括p50二聚體、p65二聚體和p50p65異源二聚體,主要發(fā)揮生理作用的是p50p65異源二聚體4。本實(shí)驗(yàn)即通過檢測NFBp65以明確AS病變中NFB的活化程度。細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)時NFB位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)機(jī)體受到外界因素如細(xì)胞因子、磷脂、脂糖、病毒、植物凝集素刺激時,在蛋白激酶核蛋白磷酸酶的作用下,IkB發(fā)生磷酸化,從NFB二聚體上解離暴露p50單靶的核定位信號,NFB得以激活,并移位入細(xì)胞核,與DNA鏈上調(diào)控眾多因子轉(zhuǎn)錄的啟動位點(diǎn)特異結(jié)合,啟動基因轉(zhuǎn)錄5。有研究表明，在有絲分裂原（Ang、FGF等）誘發(fā)的平滑肌細(xì)胞增殖的過程中，存在蛋白激酶

21、C（PKC）NFB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NFB活化后可以結(jié)合在細(xì)胞cyclinD1的啟動子而激活其轉(zhuǎn)錄，從而介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖6。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，NFBp65與PCNA呈正相關(guān)，也說明了NFB可介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖?？ňS地洛抑制NFB活化的作用可能與其抗氧化效應(yīng)有關(guān)。HINZ等7研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基可使IkB磷酸化降解而游離出NFB進(jìn)入核內(nèi),從而發(fā)揮其促平滑肌細(xì)胞增殖的作用?？ňS地洛強(qiáng)烈的抗氧化作用，可清除AS病變過程中氧化損傷所釋放的氧自由基，進(jìn)而阻斷其NFB的活化，由此可抑制平滑肌細(xì)胞增殖。    總之，卡維地洛抗AS作用與其抗氧化作用密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為抑制AS病變過程

22、中的脂質(zhì)過氧化，清除氧自由基，阻斷NFB的活化，進(jìn)而阻斷平滑肌細(xì)胞的增殖。 【參考文獻(xiàn)】   1OLIVERA P J， COXITO P M， RELO A P， et al. Inhibitory effect of carvedilol in the highconductance state of the mitochondrial permeability transition pore J. Eur J Pharmacol，2001，412（3）：231237. 2OETTL K, GREILBERGER J， ZANGGERR K， et al. Radicalscavenging and ironchelating properties of carvedilol，an antihypertensive drug with antioxiditive activity J. Biochem Pharmacal， 2001，62（2）：241248. 3RANGANNA K， YATSU F M， HAYES B E， et al. Butyrate inhibit proliferationinduced proliferating