沙苑子黃酮對輻射損傷的抗氧化保護(hù)作用

1、沙苑子黃酮對輻射損傷的抗氧化保護(hù)作用    沙苑子(Astragali Complanali)為豆科植物扁莖黃芪(Astragalus complanatusR.Br.)的干燥成熟種子,具有補(bǔ)腎、固精、縮尿、養(yǎng)肝明目的功能1。沙苑子含有多種有效成分,黃酮類是成分當(dāng)中研究得最多的一種。現(xiàn)代藥理研究證實(shí),沙苑子黃酮(flavonoids ofAs- tragalicomplanali,FAC)具有提高機(jī)體的抗癌免疫力、抗脂質(zhì)過氧化、減輕肝組織損傷程度、顯著提高肝細(xì)胞活性、促進(jìn)肝細(xì)胞增殖等作用2-3,但有關(guān)沙苑子黃酮抗氧化方面的作用還未見報道。前期的研究表明,

2、沙苑子黃 ·73·上海中醫(yī)藥雜志2011年第45卷第5期SH.J.TCM May,2011;Vol.45 No.5酮能夠提高受輻射小鼠的生存率,保護(hù)免疫器官和造血系統(tǒng),并初步證實(shí)了FAC能夠提高抗氧化酶的含量4, 所以本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用60Co射線和過氧化氫制作體內(nèi)與體外的氧化損傷模型,探討FAC抗氧化的作用。1材料與方法1.1材料1.1.1動物清潔級昆明種小鼠:雌性(由于雌雄兩性對于輻射的抗性差異很大5,故選用單一性別的小鼠作為本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動物) ,體質(zhì)量(20±2)g,清潔級, 生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇,2006/0007),使用許可證號: SYXK(蘇,2006/

3、0035),由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。1.1.2藥物與試劑沙苑子黃酮(FAC)由蘇州大學(xué)中藥研究所自制,純度>60.0%,易溶于水,制備溶液時以0.9%NaCl溶液溶解;利血生片(Leucogen Tab- lets)(江蘇吉貝爾藥業(yè)有限公司,規(guī)格:20mg/片,批號:060804);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛 (MDA)試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均為南京建成生物工程研究所的產(chǎn)品(貨號A001,A003-1,A015,A005-2)。1.2方法1.2.1動物分組及給藥均衡體質(zhì)量后的小鼠隨機(jī)分為6組,每組10只:FAC-

4、1組(400mg/kg)、FAC-2 組(200mg/kg)、FAC-3組(100mg/kg);陽性對照組 (利血生組)給予升高白細(xì)胞常用商品藥利血生 (1.4mg/kg);另設(shè)給予0.9% NaCl溶液的輻射對照組 (模型組)和正常對照組(正常組)。各實(shí)驗(yàn)組小鼠灌胃給藥,1次/d,連續(xù)7天。7天后,除正常組外,均給予 6Gy60Co射線全身輻射1次。輻射后正常飼養(yǎng)及給藥各實(shí)驗(yàn)組小鼠,連續(xù)10天,第10天處死小鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。1.2.2抗氧化酶及脂質(zhì)過氧化物的測定輻射及給藥處理后,取各實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟,冰浴條件下操作, 以0.9% NaCl溶液為勻漿介質(zhì)在勻漿器中制備10% 的組織勻漿,

5、離心后取上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照試劑盒說明書用可見光分光光度計測量SOD值、T-AOC能力、GSH-Px活力和MDA值。1.2.3氧自由基清除率的測定超氧陰離子清除率的測定6:依照鄰苯三酚自氧化法,與FAC等濃度的抗壞血酸(VC)做陽性對照。O-2清除率(%)=(A空白- A樣品)/A空白×100% ·OH清除率的測定(Fenton法)7: FAC對 H2O2系統(tǒng)產(chǎn)生的羥基自由基的清除作用以Smirnoff 等的方法為基礎(chǔ)并適當(dāng)改進(jìn),即采用亞鐵離子催化過氧化氫產(chǎn)生羥自由基(·OH)方法。與FAC等濃度的甘露醇做陽性對照。 ·OH清除率計算:·OH清

6、除率(%)=(A樣品- A空白)/(A對照-A空白)×100%. DPPH自由基清除率的測定8:2ml新配制的二苯代苦味酰肼( DPPH )溶液(2×10-4mol/L)中加入1ml 不同濃度的FAC,以VC為對照品。室溫下暗光反應(yīng) 60min,在517nm處測定其吸光值A(chǔ),平行3次。 DPPH清除率(%)=(A1-A2)/ A1×100% A1:空白吸收值(t=0min);A2:反應(yīng)60min后吸收值1.2.4小鼠紅細(xì)胞氧化溶血的測定9取一只健康小鼠摘眼球取血,用取血量5倍體積的阿氏液制備成抗凝血液,冷凍離心機(jī)中離心(1 000r/m,10min),移棄血漿和白

7、細(xì)胞得紅細(xì)胞沉淀。向紅細(xì)胞中加入等滲的 0.9%NaCl溶液,混勻,離心1 000r/m,10min,棄上清。如此反復(fù)多次洗滌紅細(xì)胞,直至上清液澄清,將得到的紅細(xì)胞用0.9%NaCl溶液制成體積分?jǐn)?shù)為1%的懸浮液。取制備好的懸浮液1ml,加不同質(zhì)量濃度的 FAC1ml,分別為FAC-1組(1.5g/L)、FAC-2組 (1.0g/L)、FAC-3組(0.5g/L)和FAC-4組(0.25g/ L)。另設(shè)陽性對照組(槲皮素組)加入公認(rèn)有抗氧化作用的槲皮素1.5g/L、0.9% NaCl溶液的氧化對照組 (模型組)和正常對照組(正常組)。各組均加入1ml 400mol/L的H2O2啟動反應(yīng),混勻,

8、置于37水浴中反應(yīng)60min,再用0.9% NaCl溶液稀釋6倍,3 000r/m離心6min,取上清液于415nm處測其吸光度值。計算樣品的溶血度與抑制率。溶血度=A2/A1×100%;抑制率=(A1-A2)/(A1- A0)×100%。A0為對照組的吸光值,A1為模型組的吸光值,A2為樣品組的吸光值1.2.5小鼠肝線粒體腫脹的抑制度10取一只健康小鼠肝臟,以pH7.4等滲磷酸緩沖液勻漿,勻漿液 1 000×g離心15min ,棄沉淀。上清于10 000×g離心15min ,沉淀以等滲磷酸緩沖液洗滌1次,10 000× g離心15min以后,

9、重新懸浮于等滲磷酸緩沖液,用 0.9% NaCl溶液配制成吸光值為0.5-0.6的肝線粒體懸浮液備用。2.5ml懸浮液各加入不同濃度FAC,分別為FAC-1組(1.5g/L)、FAC-2組(1.0g/L)、FAC-3 組(0.5g/L)和FAC-4組(0.25g/L);另設(shè)陽性對照組 (槲皮素組)加入公認(rèn)有抗氧化作用的槲皮素1.5g/L、 0.9%NaCl溶液的氧化對照組(模型組)和正常對照組 (正常組)。各組均加入1mmol/L的FeSO450l和 1mmol/L的VC50l ,在520nm處測定4個反應(yīng)時間點(diǎn)的吸光值,線粒體膜受氧化損傷而發(fā)生腫脹,吸光值下降。抑制度(%)=(A模型組-A樣

10、品組)/(A模型組-A對照組)× 100%1.2.6輻射小鼠肝臟及用藥后的HE染色按1.2.1 動物分組方法另取一批小鼠進(jìn)行輻射及給藥,常規(guī)制作各組小鼠肝臟的HE切片,在光鏡下觀察。1.2.7統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)x±s表示,采用SPSS11.0 統(tǒng)計程序進(jìn)行單因素方差分析處理,組間采用Dunnett 方法比較,等級資料用Ridit分析。2結(jié)果2.1對小鼠SOD,T-AOC,GSH-Px和MDA的影響與正常組比較,60Co模型組小鼠肝組織中的SOD含量、T-AOC能力及GSH-Px活性明顯降低,MDA含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。與模型組

11、比較,各FAC給藥組小鼠肝組織中的SOD 活性增強(qiáng),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);FAC-2組小鼠肝組織中的GSH-Px活性增強(qiáng),差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01);FAC-1組的MDA含量下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。3討論沙苑子藥理作用廣泛,具有改善血流變、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝、降脂、抗腫瘤等作用。我們前階段證實(shí)了FAC能夠通過減輕輻射造成的造血和免疫系統(tǒng)的損傷4從而延長輻射小鼠的壽命,這也與黃酮類化合物能增強(qiáng)免疫功能的報道相符合11。電離輻射產(chǎn)生的大量自由基可在體內(nèi)可引起各種損傷12。有研究表明黃酮類化合物對氧自由基等有良好的清除能力13。本實(shí)驗(yàn)以60C

12、o輻射小鼠為動物模型,以過氧化氫制作體外氧化模型,測定與抗氧化有關(guān)的指標(biāo)。3種自由基的清除率。超氧陰離子自由基、羥基自由基等活性氧自由基是在機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的。在生理狀態(tài)下,活性氧自由基處于較低的水平,其產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡。但在病理情況下,被打破的平衡將導(dǎo)致機(jī)體損傷。其中羥基自由基的危害最大,可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)采用H2O2/Fe2+體系通過Fen- ton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基,臨苯三酚自氧化系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基,研究FAC的清除自由基活性。結(jié)果表明FAC在較高濃度時有較好的體外清除O-2、·OH 的作用,顯著優(yōu)于陽性對照藥VC和甘露醇;1,1-二苯基-2-苦肼基(DP

13、PH)在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,在波長為517nm下具有最大光吸收,可借分光光度儀來檢測DPPH自由基被捕捉的情形,從而評價 FAC的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)研究表明FAC在不同濃度時具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基的作用,清除率都高達(dá)94%以上。紅細(xì)胞溶血的抑制率。過氧化誘發(fā)多不飽和脂肪酸氧化,形成過氧化脂質(zhì)(LPO)或引起紅細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化、膜蛋白發(fā)生聚集,導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血。 MDA是LPO的主要降解產(chǎn)物,通過測定MDA和紅細(xì)胞溶血程度可判斷抗氧化能力的多少。本研究采用 H2O2誘導(dǎo)的體外氧化系統(tǒng)和輻射誘導(dǎo)的體內(nèi)肝勻漿自氧化系統(tǒng)來研究FAC的抗氧化能力,結(jié)果顯示 FAC能顯著地抑制紅細(xì)胞的溶血,降低

14、MDA的含量。 線粒體腫脹的抑制率。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的主要場所,參與包括自由基生成、脂質(zhì)代謝等在內(nèi)的許多生理和生化過程。線粒體是多類藥物的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn),因此維持其結(jié)構(gòu)和功能正常對生物體的正?；顒佑兄陵P(guān)重要的意義。本研究證實(shí)FAC可降低Vit C-Fe2+系統(tǒng)誘導(dǎo)肝線粒體的腫脹,表明可對自由基過度生成而引起的線粒體功能損傷有一定的保護(hù)作用。 保護(hù)抗氧化酶系統(tǒng)及提高組織的抗氧化能力。電離輻射可激發(fā)體內(nèi)水分子生成大量自由基,引發(fā)脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng),繼而引起體內(nèi)抗氧化物質(zhì)活力的變化,打破機(jī)體的氧化-抗氧化體系的平衡。本實(shí)驗(yàn)測定的 SOD、GSH-Px均是重要的抗氧化酶類,可以反映生物機(jī)體組織對超氧化物和自由基的清除能力。SOD是體內(nèi)重要的自由基清除劑,可保護(hù)細(xì)胞膜免受氧化和脂質(zhì)過氧化損傷。比如O-2首先經(jīng)SOD生成過氧化氫, 再經(jīng)其他抗氧化酶作用最終形成水。GSH-Px主要清除體內(nèi)由自由基引起的脂質(zhì)過氧化時產(chǎn)生的大量脂質(zhì)過氧化物,還可以部分替代過氧化氫酶清除H2O2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,FAC能夠顯著的保護(hù)抗氧化酶的活性,在總抗氧化能力的檢測上也顯示出FAC能夠有效的提高受損組織的抗氧化能力,這與保護(hù)抗氧化酶的活性的結(jié)果相一致。結(jié)果