重組人生長激素對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側大腦皮質Surv

1、重組人生長激素對大鼠腦缺血/再灌注損傷后缺血側大腦皮質Survivin和 Caspase?3表達的影響                      作者：郭耀強 白宏英 曾志磊 劉海濤 方李鴻【摘要】  目的 觀察重組人生長激素(recombinant human growth hormone，rhGH)對大鼠腦缺血/再灌注損傷后缺血側大腦皮質存活素(Survivin)和半胱氨酰

2、天冬氨酸特異性蛋白酶?3 (Caspase?3)表達的影響。方法 采用大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型,將72只健康雄性SD大鼠,隨機分為假手術組、對照組和治療組。分別于模型制作成功后1、3、5、7 d處死大鼠,采用連續(xù)切片免疫組織化學技術分別檢測缺血側大腦皮質Survivin 和Caspase?3的表達。結果 治療組Survivin表達較對照組明顯增多,而Caspase?3表達較對照組顯著減少。結論 腦缺血/再灌注損傷早期應用rhGH可上調Survivin表達及下調Caspase?3表達,抑制神經(jīng)元的凋亡。 【關鍵詞】  腦缺血/再灌注損傷;重組人生長激素;Survivin;Cas

3、pase?3;細胞凋亡【Abstract】 Objective To observe the effects of recombinant human growth hormone(rhGH) on the expressions of Survivin and Caspase?3 in rats with cerebral ischemia?reperfusion injury. Methods The model of focal cerebral ischemia?reperfusion injury was made by occluding middle cerebral arter

4、y(MCA)for 2 hours and reperfusion.Seventy?two healthy male SD rats were randomly divided into the sham?operated group, control group and treatment group. And immunohistochemistry technique was used to detect the condition of the expression of Survivin and Caspase?3 in three groups respectively.Resul

5、ts The expression of Survivin was markly increased and Caspase?3 was obviously decreased in treatment group compared with control group. Conclusion It is demonstrated that treatment with recombinant human growth hormone could induce expression of Survivin and suppress the activity of Caspase?3 in ne

6、urons within the cerebral cortex. It can inhibit the neuronal apoptosis.【Key words】 Cerebral ischemia?reperfusion injury; Recombinant human growth hormone;Survivin;Caspase?3;Apoptosis重組人生長激素(recombinant human growth hormone，rhGH)在1986年通過基因工程技術合成，與人生長激素(human growth hormone, hGH)結構相同，目前主要用于治療生長激素缺乏性侏

7、儒癥、燒傷、抗炎及不育癥等。近年來,國內外研究表明,生長激素具有減輕大腦缺血缺氧引起的損傷,抑制細胞凋亡,促進細胞存活等作用1?4,但機制還不十分清楚。目前,尚未有生長激素對腦缺血/再灌注損傷后Survivin、Caspase?3表達影響的報道。本實驗通過應用rhGH觀察大鼠腦缺血/再灌注損傷后缺血側大腦皮質Survivin、Caspase?3表達的變化,探討其神經(jīng)保護作用的可能機制,為臨床治療探索新的方法及思路。1 材料與方法1.1 實驗動物和分組 健康雄性SD大鼠72只,體質量250280 g,由鄭州大學實驗動物中心提供。術前禁食12 h,禁水4 h。隨機分為假手術組、對照組(腦缺血/再灌

8、注+生理鹽水組)、治療組(腦缺血/再灌注+rhGH組)3組,每組24只。1.2 主要試劑和藥物 重組人生長激素注射液由長春金賽藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn); Survivin多克隆抗體及Caspase?3多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ生物技術公司。1.3 大鼠腦缺血/再灌注模型的制備及處理 線栓法大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型采用改良的Longa5線栓法,大腦中動脈(MCA)阻斷2 h后,將尼龍栓線拔出,實現(xiàn)再灌注。假手術組除不插線外,其余步驟與對照組和治療組相同。參照 Zea Longa 5級4分制評分標準5，評分為13分的實驗動物入選。治療組在腦缺血/再灌注模型成功后開始頸部皮下注射重組人生

9、長激素0.1 U?kg?1? d?1,1次/24 h。對照組注射同樣劑量生理鹽水,注射時間與次數(shù)同治療組。1.4 組織切片和免疫組化檢測 分別于腦缺血/再灌注后1、3、5、7 d處死大鼠,以4%多聚甲醛灌注固定,石蠟包埋和切片。常規(guī)脫蠟、水化,取缺血側大腦皮質,按試劑盒提供的實驗步驟進行操作,DAB顯色,光鏡下觀察,胞漿出現(xiàn)棕色顆粒為陽性著色。1.5 免疫組化結果分析 在光鏡下觀察Survivin 和Caspase?3免疫反應的結果,并采用Biosens Digital Imaging System v1.6(上海山富科學儀器有限公司) 圖像分析系統(tǒng)進行圖像定量分析。Survivin 和Cas

10、pase?3免疫組化染色標記強度用灰度值表示,比較各組陽性區(qū)平均灰度值的差異。1.6 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件處理,各組數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,用LSD?t法進行兩兩比較,檢驗水準=0.05。2 結果2.1 大腦皮質Survivin表達的變化 假手術組大鼠腦組織中Survivin僅有少量表達,對照組13 d達到高峰,隨后逐漸降低,至7 d仍有較高水平的表達,較假手術組顯著升高;治療組較對照組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。2.2 大腦皮質Caspase?3表達的變化 Caspase?3在假手術組少量表達,對照組13

11、d達到高峰,后開始下降,至7 d時仍高于假手術組;治療組較對照組顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。表1 各組Survivin表達的變化(陽性區(qū)平均灰度表示)注：與假手術組同一時間點比較,P<0.05;與對照組同一時間點比較, P<0.05表2 各組Caspase?3表達的變化(陽性區(qū)平均灰度表示)注：與假手術組同一時間點比較,P<0.05;與對照組同一時間點比較,P<0.053 討論腦缺血/再灌注損傷是一種常見的、復雜的病理生理過程。有研究表明6,腦缺血后隨著再灌注時間的延長,缺血側皮層凋亡細胞數(shù)量明顯增加,主要分布在梗死灶邊緣區(qū),48 h凋亡細

12、胞達到高峰,說明凋亡在腦缺血/再灌注損傷中起重要作用。半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteing aspartate specific protease, Caspase)特別是Caspase?3處于凋亡過程的下游階段,是凋亡過程中的關鍵蛋白酶,及時抑制凋亡級聯(lián)反應過程中的關鍵蛋白酶,挽救缺血半暗帶區(qū)尚未凋亡的神經(jīng)元是腦血管疾病治療的關鍵。而Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員,是至今發(fā)現(xiàn)作用最強的凋亡抑制蛋白之一,既能抑制細胞凋亡,又能誘導調控神經(jīng)細胞的有絲分裂及生長周期時相,促進神經(jīng)細胞增殖和血管生成等7?8。腦缺血/再灌注損傷能促使缺血側腦組織Survivin強烈持續(xù)高表達。我們

13、實驗觀察到腦缺血/再灌注損傷后Survivin表達升高,13 d達到高峰,隨后逐漸降低,至7 d仍有較高水平的表達,提示Survivin在腦缺血/再灌注損傷早期即參與抗凋亡的復雜生理過程。應用rhGH干預后Survivin表達顯著升高,說明腦缺血/再灌注損傷早期應用rhGH,可以增加Survivin 的合成和分泌。同時發(fā)現(xiàn),腦缺血/再灌注損傷后Caspase?3表達升高,至再灌注13 d達到高峰,隨后開始下降,至7 d時仍高于假手術組,結果與國內外報道一致,表明腦缺血/再灌注損傷與細胞凋亡存在密切的聯(lián)系,參與了腦缺血后神經(jīng)元損傷的病理過程。有研究認為9?10,生長激素可能通過NF?kappa

14、B 介導的信號轉導途徑產(chǎn)生抗凋亡蛋白Bcl?2 和BAG?1,促進細胞存活。也有實驗發(fā)現(xiàn)2,心肌缺血/再灌注24 h后生長激素組心肌細胞的凋亡以及凋亡相關基因Caspase?3、Cleaved Caspase?3蛋白陽性染色細胞數(shù)均明顯少于心肌缺血/再灌注組。我們研究發(fā)現(xiàn)應用rhGH干預后Caspase?3表達較對照組顯著下降,提示rhGH可能直接或間接通過抑制Caspase?3活性,抑制神經(jīng)元的凋亡。另有研究表明11,Survivin可能直接抑制Caspase?3和Caspase?7的活性,阻斷凋亡信號誘發(fā)的細胞凋亡,從而抑制細胞凋亡,發(fā)揮腦保護作用。綜上所述,我們認為腦缺血/再灌注損傷早期

15、應用rhGH治療,可上調Survivin表達，下調Caspase?3表達,抑制神經(jīng)元凋亡,但其具體的信號轉導通道目前尚不清楚,有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】  1 Azcoitia I, Perez?Martin M, Salazar V, et al. Growth hormone prevents neuronal loss in the aged rat hippocampusJ.Neurobiology of Aging,2005,26(5):697?703.2 黃瑞健，李萌，孫培吾.生長激素對大鼠心肌缺血/再灌注后心肌細胞凋亡及凋亡相關基因Caspase?3 Cleaned

16、caspase?3蛋白表達的影響J.中國急救醫(yī)學,2008,28(6):527?530.3 Shin DH, Lee E, Kim JW, et al. Protective effect of growth hormone on neuronal apoptosis after hypoxia?ischemia in the neonatal rat brainJ.Neuroscience Letters,2004,354(1):64?68.4 Scheepens A, Sirimanne ES, Breier BH, et al. Growth hormone as a neuronal

17、rescue factor during recovery from CNS injury J. Neuroscience, 2001，104(3):677?687.5 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in ratsJ.Stroke, 1989, 20(1): 84?91.6 段智慧，白宏英，婁季宇,等. 垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血皮層p?JNK表達及神經(jīng)細胞凋亡的影響J.中國實用神經(jīng)疾病雜志,

18、2007,10(2):51?53.7 Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti?apoptosis gene，Survivin，expressed in cancer and lymphomaJ.Nature Med，1997，3(8)：917?921.8 Conte MS，Altieri DC. Survivin regulation of vascular injury J.Trends in Cardiovascular Med，2006，16(4)：114?117.9 Jeay S, Sonenshein GE, Postel ?Vinay MC, et al. Growth hormo