熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測HBV-DNA與血清標(biāo)志物關(guān)系的研究

1、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測HBV-DNA與血清標(biāo)志物關(guān)系的研究    【摘要】nbsp;nbsp; 目的：探討乙型肝炎病毒(HBV)血清學(xué)檢測出現(xiàn)的組合模式與HBV-DNA定量之間的關(guān)系，為臨床診斷和治療提供有價(jià)值的判斷標(biāo)準(zhǔn)。方法：483例血清標(biāo)本采用ELISA方法對其免疫學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行檢測，并用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)技術(shù)檢測血清H     作者：彭端亮,魏運(yùn)順    作者單位：1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院,四川 簡陽 641400;2.簡陽市計(jì)劃生育和人口服務(wù)

2、站,四川 簡陽 641400 【摘要】  目的：探討乙型肝炎病毒(HBV)血清學(xué)檢測出現(xiàn)的組合模式與HBV-DNA定量之間的關(guān)系，為臨床診斷和治療提供有價(jià)值的判斷標(biāo)準(zhǔn)。方法：483例血清標(biāo)本采用ELISA方法對其免疫學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行檢測，并用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)技術(shù)檢測血清HBV-DNA。結(jié)果：經(jīng)FQ-PCR檢測，142 例HBsAg(+),HBeAg(+),HBcAb(+)的標(biāo)本，其HBV-DNA檢出率97.89(139例)，平均HBV-DNA拷貝數(shù)為6.92E 7 copies/ml；205例HBsAg(+),HBeAb(+),HBcAb(+)的標(biāo)本，其HBV-D

3、NA檢出率49.27(101例)，平均HBV-DNA拷貝數(shù)為4.35E 6 copies/ml；48例HBsAg(+),HBcAb(+)的標(biāo)本其HBV-DNA檢出率47.91(23例)，平均HBV-DNA拷貝數(shù)為7.05E 6 copies/ml。結(jié)論：熒光定量PCR檢測血清HBV-DNA準(zhǔn)確靈敏，可以檢測HBV的真實(shí)感染和復(fù)制狀態(tài)，結(jié)合乙肝病毒的血清標(biāo)志物檢測，對于乙肝臨床診斷，治療方案的選擇，療效觀察及預(yù)后判斷有極其重要的作用。 【關(guān)鍵詞】  乙型肝炎病毒；乙肝標(biāo)志物；ELISA；熒光定量PCR Study on the Relation Between Hepatitis B

4、virus DNA Detected by Fluorescence Quantitative PCR and Hepatitis B Virus Markers PENG Duan-liang,WEI Yun-shun (The Affiliated Hospital of Sichuan Medical Sciences Academy,Jianyang,Sichuan 641400,China)    Abstract:Objective To explore the relationship between the different patterns o

5、f HBV markers and HBV-DNA quantity for the diagnosis and treatment of hepatitis B.Methods HBV M and HBV-DNA was tested in serum samples by ELISA  乙型肝炎是一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，每年有100萬人死于本病，我國為乙肝高發(fā)區(qū)，約有12億人為乙肝病毒攜帶者1。乙肝病毒血清標(biāo)志物即兩對半的檢測是常用方法之一，其方便快捷，成本低廉，但ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))只能提供陰陽性的判斷，不能提供乙肝病毒的的具體含量。隨著分

6、子生物學(xué)的發(fā)展2，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)技術(shù)廣泛用于臨床的診斷和治療，它是直接檢測血清中的乙肝病毒DNA，HBV-DNA是反映人體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制的直接指標(biāo)，也是最特異，最靈敏的指標(biāo)，不同的病毒數(shù)量反映了乙肝病毒在患者肝臟中的復(fù)制情況。筆者通過檢測乙肝患者血清病毒標(biāo)志物和其中病毒的含量，將二者結(jié)果進(jìn)行總結(jié)分析，了解他們之間的關(guān)系，并找出一定規(guī)律，以研究該方法的實(shí)用性及臨床應(yīng)用價(jià)值。 1  材料與方法 1.1 材料   乙肝患者血清標(biāo)本來源于我院2007年12月至2008年5月的門診和住院病人，共計(jì)483份，男305人，女178人，平均年齡45歲，臨床診

7、斷均符合2000年全國傳染病與寄生蟲病學(xué)術(shù)會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn)3。 1.2 儀器與試劑    血清標(biāo)志物儀器為Wellscan MK3酶標(biāo)儀測定，試劑由北京萬泰公司提供；HBV-DNA檢測儀器為羅氏公司Lightcycler 2.0熒光定量擴(kuò)增儀。 1.3 方法   乙肝血清標(biāo)志物采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA法)，嚴(yán)格按操作說明檢測，結(jié)果由MK3酶標(biāo)儀測定，每一批標(biāo)本均設(shè)陰陽性和臨界對照。熒光定量PCR測定HBV-DNA嚴(yán)格按試劑盒說明書和儀器廠家提供的方法進(jìn)行。每次試驗(yàn)設(shè)立4個(gè)HBV-DNA標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度，分別為5×104，5×

8、;105；5×106；5×107，其檢測靈敏度為1×103 copies/ml，嚴(yán)格按照Kword4等提出的防污染措施進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    定量結(jié)果采用求算術(shù)平均值的方法計(jì)算HBV-DNA平均拷貝數(shù)；組間樣本率比較采用u檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)，最后用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)處理。 2 結(jié)果  血清標(biāo)志物經(jīng)ELISA檢測可分為以下幾種組合模式： 結(jié)果顯示：標(biāo)志乙肝感染期的血清HBsAg, HBeAg,HBcAb均陽性的標(biāo)本(俗稱大三陽)，142例中FQ-PCR檢測HBV-DNA幾乎全為陽性(陽性率為97.89),

9、標(biāo)志長期HBV攜帶者的血清HBsAg, HBeAb, HBcAb(俗稱小三陽)的205例標(biāo)本中FQ-PCR檢測HBV-DNA有101例為陽性(陽性率為49.27)。其余各種HBsAg陰性的常見血清標(biāo)志物模式均有不同程度的HBV-DNA陽性率。在出現(xiàn)HBeAb 和HBcAb轉(zhuǎn)換的慢性乙肝血清中，有13.3的病例HBV-DNA陽性，說明這些抗體出現(xiàn)并不能標(biāo)志HBV復(fù)制的停止；標(biāo)志恢復(fù)期的HBsAb HBeAb 和HBcAb均陽性的30例標(biāo)本中，6例陽性，且拷貝數(shù)較低。這些都說明依據(jù)酶免法檢測乙肝病毒的感染及治療情況并不完全可靠，通過列表進(jìn)行對比，我們可以找出乙肝病毒血清標(biāo)志物和HBV-DNA數(shù)量之

10、間的相關(guān)性。表1  血清標(biāo)志物模式（略）表2  各組FQ-DNA定量結(jié)果（略） 3 討論  乙肝血清標(biāo)志物是HBV感染的實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)檢測手段，它檢測的是抗體，是反映人體對HBV的免疫應(yīng)答狀態(tài)，由于HBV的表達(dá)和機(jī)體免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱受多種因素影響5，因此，反映患者體內(nèi)病毒復(fù)制時(shí)有一定局限性。而PCR技術(shù)可檢測病毒的DNA，即HBV的拷貝數(shù)，能準(zhǔn)確地反映病程變化和治療恢復(fù)情況。從本組實(shí)驗(yàn)研究表明：乙型肝炎患者血清HBV標(biāo)志物不同，其HBV-DNA陽性率各異。在大三陽，即HBsAg, HBeAg HBcAb均陽性的患者中，HBV-DNA陽性率最高，為97.89；其次HBsA

11、g, HBeAg陽性的患者HBV-DNA陽性率也為較高狀態(tài)，達(dá)95.45。然后是在小三陽即HBsAg, HBeAb, HBcAb均陽性的患者中HBV-DNA陽性率為49.27，再下來才是HBsAg，HBcAb陽性的患者。說明HBeAg陽性是病毒復(fù)制活躍的標(biāo)志，結(jié)果顯示HBeAg陽性者HBV-DNA含量明顯高于陰性者，而陰性者中仍有HBV-DNA陽性(49.27)，說明即使HBeAg陰轉(zhuǎn)HBV-DNA復(fù)制并不一定停止，提示HBV-DNA復(fù)制處于較低水平或可能已和宿主DN整合并潛伏下來，這種情況可能與前C區(qū)變異有關(guān)，部分患者仍有傳染性。因此，我們不能單純地認(rèn)為，HBeAg陰轉(zhuǎn)是HBV復(fù)制減弱或病情

12、好轉(zhuǎn)的信號，特別是HBeAb陽性，轉(zhuǎn)氨酶異常的患者應(yīng)及時(shí)進(jìn)行HBV-DNA定量檢測，這樣才有助于病情的判斷及治療方案的選擇。 表中后面的幾組數(shù)據(jù)顯示，即使在血清標(biāo)志物中HBsAg為陰性的情況下也不能完全排除乙型肝炎病毒的感染，主要原因是患者處于感染初期或低水平的HBV感染，導(dǎo)致血清標(biāo)志物消失或濃度偏低，也可能是由于編碼HBsAg的HBV S區(qū)基因發(fā)生點(diǎn)突變所致，使得ELISA法不能測出乙肝病毒標(biāo)志物，但聚合酶鏈反應(yīng)靈敏度高，可檢測出低濃度的HBV-DNA。所以有條件的地區(qū)在進(jìn)行獻(xiàn)血員篩選時(shí)最好同時(shí)進(jìn)行乙肝病毒標(biāo)志物和HBV-DNA的檢測，這樣既能發(fā)現(xiàn)HBV感染者的窗口期，又能避免某些

13、HBV低水平復(fù)制的漏檢，以便最大限度地減少輸血后乙肝病毒的傳播。HBsAg雖然是HBV感染的特異性指標(biāo)，但并不是血液HBV攜帶者具有傳染性的直接指標(biāo)。血清中HBV陽性的病例其傳染性大小可能與HBV-DNA滴度有關(guān)，在藥物治療方面，對藥物無反應(yīng)者，HBV-DNA輕微下降或無變化；對藥物有反應(yīng)者，HBV-DNA在治療后明顯下降或至無法測出；隨訪時(shí)HBV-DNA水平明顯升高，提供病毒仍在復(fù)制，病情可能出現(xiàn)反復(fù)或加重，所以HBV-DNA檢測在評價(jià)和監(jiān)測抗病毒藥物療效等方面具有十分重要的臨床價(jià)值。HBV-DNA定量檢測能正確反映病毒復(fù)制情況，是乙肝病毒治療唯一有效的直接療效指標(biāo)6。 以上分析表

14、明：單純依靠乙肝血清標(biāo)志物的檢測結(jié)果來進(jìn)行診斷及判斷病情是不夠的，它只能較好地反映機(jī)體對乙肝病毒感染的免疫應(yīng)答狀況，而熒光定量PCR可以定量檢測HBV-DNA的濃度，且靈敏度高，特異性強(qiáng)，更能清楚地反映乙肝患者的病毒活動(dòng)程度，真實(shí)地反映HBV的感染和復(fù)制情況，二者需要辯證地看待，各有其長，又有著必然的聯(lián)系，只有將兩種方法有機(jī)地結(jié)合起來，對乙肝標(biāo)志物進(jìn)行綜合分析，才能對臨床診斷，治療方案設(shè)計(jì)，藥物療效觀察提供可靠的依據(jù)。 【參考文獻(xiàn)】  1劉樹林, 鄒菊賢. PCR檢測 HBV-DNA與 HBV血清標(biāo)志物常見模式和Pre-S2相互關(guān)系研究J.重慶醫(yī)學(xué),2001,30(2):100-101.2林杓鋒,李校坤,吳 帆,等.實(shí)行定量PCR在乙型肝炎(HBV)診斷中的應(yīng)用J.中國生物工程雜志,2002,22(3):68-70.3中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì), 肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂.病毒性肝炎防治方案J.中華傳染病雜志,2001,19(1):56-62.4KWORS,HIGUCHIR.Avoiding false positives with PCRJ.Natur