細胞生物學實驗報告1-動物細胞融合

1、. 山東大學實驗報告 2011年09 月 16 日 姓名 孫嘉璋 系年級 2010及臨床八年 組別 同組者 科目 細胞生物學實驗 題目 動物細胞融合 學號 201000232115 【實驗?zāi)康摹?. 了解動物細胞融合的常用方法2. 學習化學融合和電融合的基本操作3. 觀察動物細胞融合過程中的行為和變化【實驗原理】1. 病毒誘導融合仙臺病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒等可以介導細胞的融合。這類病毒的被膜中含有融合蛋白，可以介導病毒同宿主細胞融合，也可以介導細胞與細胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導細胞發(fā)生融合。2. 化學誘導融合很多化學試劑都能誘導細胞融合，如聚乙二醇（PEG），二

2、甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂，磷脂酰絲氨酸等。這些物質(zhì)能夠改變細胞膜脂質(zhì)分子的排列，在去除這些物質(zhì)之后，細胞膜趨向于恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)。在恢復(fù)的過程中相接處的細胞由于接口處脂質(zhì)雙分子層的相互親和與表面張力，細胞膜融合，胞質(zhì)流通，發(fā)生融合。化學誘導方法，操作方便，誘導融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動、植物細胞，但對細胞具有一定的毒性。PEG是被廣泛使用的化學融合劑。3. 電擊誘導融合包括電誘導、激光誘導等。其中，電誘導是先使細胞在電場中極化成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強度、短時程的電脈沖擊破細胞膜，細胞膜的脂質(zhì)分子發(fā)生重排，由于表面張力作用，兩細胞發(fā)生融合。電誘導方法具有融

3、合過程易控制，融合概率高，作用機制明確，可重復(fù)性高等優(yōu)點?！緦嶒灢牧稀?. 材料 雞血紅細胞2. 試劑 50%PEG、0.85%氯化鈉溶液、GKN緩沖溶液3. 器材 倒置顯微鏡、離心機、量筒、注射器、載玻片、蓋玻片、離心管等【實驗步驟】1. 取離心管，加入冷藏的雞血1ml，加入4ml 0.85%氯化鈉溶液，搖勻2. 將離心管放入離心機中，以1000-1200r/min的速度離心5分鐘左右。取出離心管，棄掉上清液，再加入4ml氯化鈉溶液，重復(fù)以上操作。3. 取離心管，棄掉上清液后，按照紅細胞沉積的體積，加入1-2mlGKN溶液，搖勻。4. 取以上溶液1ml，加入3mlGKN溶液，再次搖勻5. 取

4、以上溶液1ml，加入0.5mlPEG，先靜置1-2min，再將溶液搖勻后，靜置1-2min。6. 用滴管取溶液制成涂片，置于顯微鏡下觀察?！緦嶒灲Y(jié)果】最初，在顯微鏡下觀察到的細胞如下二圖所示。其中，第二圖中指針所指的兩細胞緊貼在一起，有相互融合的趨勢。由于在第二步稀釋的過程中未充分振蕩，使得許多細胞都聚集在一起成堆，影響了細胞的觀察。因此，我又重新充分稀釋并振蕩了細胞懸液，并重新制備了涂片，所得的新影響如下圖：在上圖中，可以明顯看出箭頭所指的兩細胞中間的細胞膜已經(jīng)消失。有著明顯的融合的現(xiàn)象了?！緦嶒灲Y(jié)果分析與注意事項】本次試驗最終觀察到了明顯的細胞融合，可以說較為成功。其中重新稀釋振蕩細胞懸液

5、并重置涂片，使得能夠看到明顯的細胞融合現(xiàn)象。而其他實驗組也出現(xiàn)了類似情況，都是細胞懸液稀釋程度不夠，制成的圖片在顯微鏡下呈現(xiàn)大塊的細胞堆積，難以觀察到明顯而清晰的單個細胞，更不用說兩個細胞的融合了。因此在本次試驗中，第一個注意事項便是充分地稀釋和振蕩搖勻細胞懸液，達到試驗的細胞濃度要求（17000個/毫升左右）。許多實驗組由于在制備的第五步（滴入PEG）過程中，滴入PEG后立刻搖勻了細胞懸液，并沒有讓PEG沉降到細胞懸液底部后，在保持高濃度的情況下與接觸面的細胞充分反應(yīng)，使得所觀察到了細胞融合率不高，觀察效果不明顯。因此，讓PEG與細胞懸液分層靜置足夠的時間也是十分重要的。另外，包括我組在內(nèi)的

6、許多實驗組在觀察細胞是發(fā)現(xiàn)目標細胞總是在不規(guī)則移動，十分影響細胞的觀察。根據(jù)指導老師的說法，這是由于涂片的懸液量太多導致細胞在懸液內(nèi)流動所致。因此，在制片時，適當?shù)膽乙毫渴切枰⒁獾?。不能過多，當然也不能過少。附：細胞融合技術(shù)的應(yīng)用1. 單克隆抗體動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系，具有不同基因不同的B淋巴細胞合成不同的抗體。當機體受抗原刺激時，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細胞。被激活的B細胞分裂增殖形成效應(yīng)B細胞（漿細胞）和記憶B細胞，大量的漿細胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個制造一種專一抗體的漿細胞進行培養(yǎng)，就可得到由單細胞經(jīng)分裂增殖

7、而形成細胞群，即單克隆。單克隆細胞將合成針對一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。1975年分子生物學家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在細胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠脾細胞融合，成為雜交細胞系，既具有瘤細胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細胞的合成和分泌特異性抗體的特點。將這種雜交瘤作單個細胞培養(yǎng)，可形成單細胞系，即單克隆。利用培養(yǎng)或小鼠腹腔接種的方法，便能得到大量的、高濃度的、非常均一的抗體，其結(jié)構(gòu)、氨基酸順序、特異性等都是一致的，而且在培養(yǎng)過程中，只要沒有變異，不同時間所分泌的抗體都能保持同樣的結(jié)構(gòu)與機能

8、。這種單克隆抗體是用其他方法所不能得到的。這項新技術(shù)從根本上解決了在抗體制備中長期存在的特異性和可重復(fù)性問題，可用于探討蛋白質(zhì)的精細結(jié)構(gòu)；淋巴細胞亞群的表面新抗原；組織相容性抗原；激素和藥物的放射免疫（或酶免疫）分析；腫瘤的定位和分類；純化微生物和寄生蟲抗原；免疫治療和與藥物結(jié)合的免疫-化學療法 (“導彈”療法,利用單克隆抗體與靶細胞特異性結(jié)合，將藥物帶至病灶部位。因此，單克隆抗體可直接用于人類疾病的診斷、預(yù)防、治療以及免疫機制的研究，為人類惡性腫瘤的免疫診斷與免疫治療開辟了廣闊前景。2. 植物細胞融合育種植物細胞融合可分為體細胞雜交和配子-體細胞雜交，前者是指不經(jīng)過有性生殖，而直接由體細胞原

9、生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜種細胞，形成愈傷組織，并再生出植株的過程，后者是指性細胞原生質(zhì)體和二倍體原生質(zhì)體融合產(chǎn)生三倍體雜種細胞，形成愈傷組織，并再生出植株的過程。植物細胞融合是植物細胞工程的一個重要分支，是一種突破物種生殖隔離、創(chuàng)造遠緣雜交的新途徑。自1960年Cocking用酶解法分離出番茄根原生質(zhì)體后，Nataga和Takebe1970年首次利用煙草葉分離出原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)獲得再生植株；1975年以色列的Vardi等首次從木本植物shamonti甜橙珠心組織誘導胚愈傷組織，并從愈傷組織分離原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)通過胚狀體再生出植株；在禾本科植物中，除災(zāi)珍珠谷、紫狼尾草用懸浮細胞為材料，較早獲得原生質(zhì)體再生植株外，直到1985年Fujimura等率先在水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得了再生植株，才出現(xiàn)了重大突破。現(xiàn)在已從許多種內(nèi)、種間、屬間甚至亞科間的體細胞雜交獲得雜交細胞系或雜種植物。隨著多種細胞原生質(zhì)體的成功培養(yǎng)和融合技術(shù)的不斷改進，植物細胞融合獲得了巨大成功。目前已經(jīng)成功得到的融合植株有甘藍-青菜、大豆-馬塘草、矮牽牛-龍面花、大