基礎(chǔ)學(xué)習(xí)實驗食管癌細(xì)胞系總蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定ppt課件

1、A 食管癌細(xì)胞系及總蛋白提取食管癌細(xì)胞系及總蛋白提取A 總蛋白的總蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定A 食管正常細(xì)胞與食管癌細(xì)胞的差異蛋白鑒定食管正常細(xì)胞與食管癌細(xì)胞的差異蛋白鑒定綜合性設(shè)計性實驗綜合性設(shè)計性實驗-2-21v食管癌是我國常見的惡性腫瘤食管癌是我國常見的惡性腫瘤v在消化道惡性腫瘤中僅次于胃癌在消化道惡性腫瘤中僅次于胃癌v發(fā)生于食管粘膜上皮發(fā)生于食管粘膜上皮v絕大多數(shù)為鱗癌、小部分為腺癌絕大多數(shù)為鱗癌、小部分為腺癌2中國是食管癌死亡率最高的國家中國是食管癌死亡率最高的國家, 在六大食管癌高發(fā)區(qū)中在六大食管癌高發(fā)區(qū)中 ,只有潮汕高發(fā)區(qū)地處中只有潮

2、汕高發(fā)區(qū)地處中國南部和沿海地理位置國南部和沿海地理位置,其中其中,又以南澳縣最高又以南澳縣最高,食管癌粗死亡率在食管癌粗死亡率在 100/ 10萬以上萬以上,其次為揭陽和饒平地區(qū)。與中國其它食管癌高發(fā)地區(qū)相比較其次為揭陽和饒平地區(qū)。與中國其它食管癌高發(fā)地區(qū)相比較,該地區(qū)在地理位置、該地區(qū)在地理位置、氣候條件、居民的生活習(xí)慣等方面均有明顯不同。氣候條件、居民的生活習(xí)慣等方面均有明顯不同。3食管癌細(xì)胞系及總蛋白提取食管癌細(xì)胞系及總蛋白提取4細(xì)胞系（細(xì)胞系（cell line） 原代細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)首次培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代傳代成功后所繁殖的細(xì)胞群體。成功后所繁殖的細(xì)胞群體。 也指可長期連續(xù)傳也指可長

3、期連續(xù)傳代的培養(yǎng)細(xì)胞。代的培養(yǎng)細(xì)胞。 腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有并具有不死性不死性和和異體接種致瘤性異體接種致瘤性。 已在細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等方面得到越來越廣泛的應(yīng)用已在細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等方面得到越來越廣泛的應(yīng)用.其其已被用于基因定位、檢測理化因素的毒性和細(xì)胞因子活性、生產(chǎn)已被用于基因定位、檢測理化因素的毒性和細(xì)胞因子活性、生產(chǎn)單克隆抗單克隆抗體體、制備、制備組織工程化人工器官組織工程化人工器官和和轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物等方面等方面,更是研究發(fā)育生物學(xué)、更

4、是研究發(fā)育生物學(xué)、腫瘤發(fā)生學(xué)腫瘤發(fā)生學(xué)、腫瘤治療腫瘤治療等不可或缺的材料等不可或缺的材料. 56細(xì)胞系名稱細(xì)胞系名稱 特點特點EC109 中國男性中國男性 食管鱗癌細(xì)胞食管鱗癌細(xì)胞EC9706 中國男性中國男性 65歲歲 病理診斷為食管蕈傘型高分化鱗病理診斷為食管蕈傘型高分化鱗 癌細(xì)胞癌細(xì)胞TE3 日本男性日本男性 48歲歲 起源于高分化食管鱗癌起源于高分化食管鱗癌 轉(zhuǎn)移至右轉(zhuǎn)移至右 胸壁細(xì)胞胸壁細(xì)胞 KYSE150 日本女性日本女性 49歲歲 低分化食管鱗癌細(xì)胞低分化食管鱗癌細(xì)胞KYSE180 日本男性日本男性 53歲歲 高分化食管鱗癌細(xì)胞高分化食管鱗癌細(xì)胞KYSE510 日本男性日本男性

5、67歲歲 在順鉑藥物治療與放射治療后在順鉑藥物治療與放射治療后 高高 分化的食管鱗癌細(xì)胞分化的食管鱗癌細(xì)胞HeLa 美國女性美國女性 子宮頸癌細(xì)胞系子宮頸癌細(xì)胞系SHEEC 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院建立的食管癌細(xì)胞系汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院建立的食管癌細(xì)胞系7癌細(xì)胞生長特性癌細(xì)胞生長特性無限增殖無限增殖在適宜條件下，癌細(xì)胞能無限增殖，成為在適宜條件下，癌細(xì)胞能無限增殖，成為“不死不死”的永生細(xì)胞。正常細(xì)胞都具有一定的永生細(xì)胞。正常細(xì)胞都具有一定的最高分裂次數(shù)，如人的細(xì)胞一生只能分裂的最高分裂次數(shù)，如人的細(xì)胞一生只能分裂5060次。然而癌細(xì)胞卻失去了最高分裂次。然而癌細(xì)胞卻失去了最高分裂次數(shù)。如在次數(shù)。如在1951

6、年由一位年由一位黑人婦女黑人婦女（名叫（名叫Henrietta Lacks)的宮頸癌的宮頸癌細(xì)胞分離細(xì)胞分離建立的建立的HeLa細(xì)胞系細(xì)胞系，至今仍在世界許多實驗室中廣泛，至今仍在世界許多實驗室中廣泛傳代傳代使用。使用。接觸抑制現(xiàn)象喪失接觸抑制現(xiàn)象喪失正常細(xì)胞生長相互接觸后，其運動和分裂活動都要停頓下來。在體外培養(yǎng)條件下則表正常細(xì)胞生長相互接觸后，其運動和分裂活動都要停頓下來。在體外培養(yǎng)條件下則表現(xiàn)為細(xì)胞貼壁生長匯合成單層后即停止生長。癌細(xì)胞則不同，其分裂和增殖并不因細(xì)現(xiàn)為細(xì)胞貼壁生長匯合成單層后即停止生長。癌細(xì)胞則不同，其分裂和增殖并不因細(xì)胞相互接觸而終止，在體外培養(yǎng)時細(xì)胞可堆累成立體細(xì)胞群

7、，故癌細(xì)胞接觸對癌細(xì)胞胞相互接觸而終止，在體外培養(yǎng)時細(xì)胞可堆累成立體細(xì)胞群，故癌細(xì)胞接觸對癌細(xì)胞的的增殖增殖無抑制作用。無抑制作用。癌細(xì)胞間粘著性減弱癌細(xì)胞間粘著性減弱癌細(xì)胞與其同源正常組織相比，細(xì)胞間的粘著性降低，故癌細(xì)胞在體內(nèi)容易分散和轉(zhuǎn)癌細(xì)胞與其同源正常組織相比，細(xì)胞間的粘著性降低，故癌細(xì)胞在體內(nèi)容易分散和轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞的纖連粘蛋白顯著減少或缺失，鈣粘蛋白合成發(fā)生障礙，從而破壞了細(xì)胞移。癌細(xì)胞的纖連粘蛋白顯著減少或缺失，鈣粘蛋白合成發(fā)生障礙，從而破壞了細(xì)胞與基質(zhì)之間和細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘著，因此癌細(xì)胞具有易于侵潤組織和轉(zhuǎn)移的屬性。與基質(zhì)之間和細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘著，因此癌細(xì)胞具有易于侵潤組織和

8、轉(zhuǎn)移的屬性。8易于被凝集素凝集易于被凝集素凝集癌細(xì)胞凝集性增強是由于質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生深刻變化所致。糖蛋白在質(zhì)膜中的運動性增強，癌細(xì)胞凝集性增強是由于質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生深刻變化所致。糖蛋白在質(zhì)膜中的運動性增強，因而凝集素更容易將其受體（糖蛋白）簇集，形成更多的橫橋。質(zhì)膜糖蛋白運動性增因而凝集素更容易將其受體（糖蛋白）簇集，形成更多的橫橋。質(zhì)膜糖蛋白運動性增強還可能是由于與其相連的微絲受到破壞所致。強還可能是由于與其相連的微絲受到破壞所致。粘壁性下降粘壁性下降葡糖胺聚糖是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，可形成水合凝膠。癌細(xì)胞合成葡糖胺聚糖葡糖胺聚糖是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，可形成水合凝膠。癌細(xì)胞合成葡糖胺聚糖減

9、少，導(dǎo)致細(xì)胞粘壁性能下降。減少，導(dǎo)致細(xì)胞粘壁性能下降。細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂癌細(xì)胞中微管變短，排列紊亂，微絲亦發(fā)生結(jié)構(gòu)異常。肌動蛋白絲的量減少，引起質(zhì)癌細(xì)胞中微管變短，排列紊亂，微絲亦發(fā)生結(jié)構(gòu)異常。肌動蛋白絲的量減少，引起質(zhì)膜流動性增強，細(xì)胞屬性發(fā)生改變。由于細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞外形亦發(fā)生改膜流動性增強，細(xì)胞屬性發(fā)生改變。由于細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞外形亦發(fā)生改變。例如培養(yǎng)中的正常成纖維細(xì)胞呈扁平梭形，但被鳥類肉瘤病毒（含變。例如培養(yǎng)中的正常成纖維細(xì)胞呈扁平梭形，但被鳥類肉瘤病毒（含src癌基因）轉(zhuǎn)癌基因）轉(zhuǎn)化后，則變成球形，表面出現(xiàn)小泡，此即由于細(xì)胞骨架成分紊亂所致?；?，

10、則變成球形，表面出現(xiàn)小泡，此即由于細(xì)胞骨架成分紊亂所致。9食管癌細(xì)胞系食管癌細(xì)胞系 Ec10910食管癌細(xì)胞系食管癌細(xì)胞系 EC970611食管癌細(xì)胞系食管癌細(xì)胞系 KYSE15012食管癌細(xì)胞系食管癌細(xì)胞系 KYSE18013準(zhǔn)備凝膠電泳的樣品，需要對細(xì)胞和組織進(jìn)行裂解以釋放目的蛋白，這準(zhǔn)備凝膠電泳的樣品，需要對細(xì)胞和組織進(jìn)行裂解以釋放目的蛋白，這些可溶性蛋白能夠穿過分離膠單獨移動。些可溶性蛋白能夠穿過分離膠單獨移動。細(xì)胞總蛋白的來源細(xì)胞總蛋白的來源細(xì)胞總蛋白的來源細(xì)胞總蛋白的來源14蛋白樣本制備的原則蛋白樣本制備原則方法應(yīng)具備標(biāo)準(zhǔn)化，具有重現(xiàn)性方法應(yīng)具備標(biāo)準(zhǔn)化，具有重現(xiàn)性 、可靠性、簡便性

11、；、可靠性、簡便性；盡量抽提完全；盡量抽提完全；應(yīng)使所有蛋白全部處于溶解狀態(tài)應(yīng)使所有蛋白全部處于溶解狀態(tài)防止發(fā)生蛋白的降解、聚集、沉淀、變性防止發(fā)生蛋白的降解、聚集、沉淀、變性防止在抽提過程中發(fā)生化學(xué)修飾防止在抽提過程中發(fā)生化學(xué)修飾如做如做2D則需去除高豐度蛋白或無關(guān)蛋白則需去除高豐度蛋白或無關(guān)蛋白必要時去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白必要時去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。15學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的原理測定蛋白質(zhì)分子量的原理掌握垂直板電泳的操作方法掌握垂直板電泳的操作方法 了解蛋白印跡技術(shù)原理和方法了解蛋白印跡技術(shù)原理和方法實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康牡诙糠?，第二部分，食管癌?xì)胞系總蛋

12、白的食管癌細(xì)胞系總蛋白的SDS-PAGE電泳分離電泳分離16帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（多用聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖凝膠。）和瓊脂糖凝膠。電泳的概念和分類電泳的概念和分類17聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠是

13、由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱，簡稱Acr)和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，簡稱，簡稱Bis)在加速劑在加速劑N,N,N ,N -四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N,N,N ,N -tetramethyl ethylenedia mine，簡稱，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡稱，簡稱AP)或核黃素或核黃素(ribofavin即即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此

14、凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱，簡稱PAGE)。單體丙烯酰胺和單體丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺的聚合甲叉雙丙烯酰胺的聚合催化劑催化劑AcrBis18聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺凝膠中主要取決于三種因素：蛋白大小，形狀和電荷。聚丙烯酰胺凝膠中主要取決于三種因素：蛋白大小，形狀和電荷。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳:是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉）。（十二烷基硫酸

15、鈉）。1967年，年，Shapiro等人首先發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的十二烷等人首先發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉（基硫酸鈉（SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量大小。），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量大小。SDS-PAGE的原理的原理SDS的分子式的分子式19SDS是一種陰離子去垢劑，是一種陰離子去垢劑，SO32-帶負(fù)電荷。因此蛋白質(zhì)在含有強還原劑的帶負(fù)電荷。因此蛋白質(zhì)在含有強還原劑的SDS溶液中溶液中與與SDS分子結(jié)合時，可形成分子結(jié)合時，可形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這種復(fù)合物由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷

16、的蛋白質(zhì)復(fù)合物。這種復(fù)合物由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了。從而，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了。從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用。起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用。SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，使蛋白復(fù)合物分解成多個亞基。氨酸之間的二硫鍵斷裂，使蛋白復(fù)合物分解成多個亞基。因此在電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)（亞基）分子大小。因

17、此在電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)（亞基）分子大小。使聚丙烯酰胺凝膠具有分子篩效應(yīng)。使聚丙烯酰胺凝膠具有分子篩效應(yīng)。SDS的作用的作用20當(dāng)分子量在當(dāng)分子量在15KD到到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX式中：式中：MW為分子量，為分子量，X為遷移率，為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)

18、曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在在SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量。的亞基或單條肽鏈的分子量。分子量分子量相對遷移率相對遷移率21被分離物質(zhì)分子量與凝膠濃度的選擇被分離物質(zhì)分子量與凝膠濃度的選擇分子量范圍分子量范圍

19、適用的凝膠濃度適用的凝膠濃度(%)蛋蛋 白白 質(zhì)質(zhì) 104 20-301-410415-201-5104-110510-1511055-10 51052-5核核 酸酸(DNA/RNA) 104 15-201041055-10 105-21062-2.622按照緩沖液的按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類：值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類： 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)分離。和分子篩效應(yīng)分離

20、。 不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分、不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度以及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒、凝膠濃度以及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。及分辨率均較前者佳。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分類：聚丙烯酰胺凝膠電泳分類：23不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.

21、7的的Tris-HC1。分離膠是由分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、種緩沖體系、3種種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。不連續(xù)系統(tǒng)的特點不連續(xù)系統(tǒng)的特點24濃縮膠的作用濃縮膠的作用濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，濃縮膠

22、的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選當(dāng)樣品液和濃縮膠選Tris/HCL緩沖液，電級液選緩沖液，電級液選Tris/甘氨酸。電泳開始后，甘氨酸。電泳開始后，HCL解離解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動，成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，

23、因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強度與低電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。25A. 為電泳前為電泳前2層凝膠排列順序，層凝膠排列順序，2層膠中均有快離子，慢離子層膠中均有快離子，慢離子B. 顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮

24、成極窄的區(qū)帶。C. 顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。電泳中離子運動示意圖電泳中離子運動示意圖26蛋白質(zhì)印跡法又稱為免疫印跡法，這是一種用抗原抗體的特異性結(jié)合來檢測固定在固相蛋白質(zhì)印跡法又稱為免疫印跡法，這是一種用抗原抗體的特異性結(jié)合來檢測固定在固相載體上蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)技術(shù)方法。載體上蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)技術(shù)方法。 蛋白質(zhì)印跡（蛋白質(zhì)印跡（western blotting）的概念）的概念27將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素/PVDF膜上，然后與能特膜上，然后與能特異性識別待檢測蛋白的一抗（針對待測分

25、子的單克隆抗體或多克隆抗體）進(jìn)行反應(yīng)；異性識別待檢測蛋白的一抗（針對待測分子的單克隆抗體或多克隆抗體）進(jìn)行反應(yīng)；洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入二抗（針對一抗的抗體，標(biāo)記有放射性同位洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入二抗（針對一抗的抗體，標(biāo)記有放射性同位素或生物素）；素或生物素）；反應(yīng)一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測試劑反應(yīng)一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進(jìn)進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半

26、定量。行特異性蛋白的半定量。蛋白印跡基本步驟蛋白印跡基本步驟281.固體相上的蛋白質(zhì)固體相上的蛋白質(zhì)2.針對蛋白質(zhì)的特異性抗體，稱為一抗針對蛋白質(zhì)的特異性抗體，稱為一抗3.帶上辣根過氧化物酶針對一抗的抗體，稱為二抗帶上辣根過氧化物酶針對一抗的抗體，稱為二抗4.加入底物，在酶的作用下，分解產(chǎn)生熒光加入底物，在酶的作用下，分解產(chǎn)生熒光29垂直電泳系統(tǒng)垂直電泳系統(tǒng)30蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)31陽極陽極陰極陰極濾紙濾紙凝膠凝膠膜膜多孔墊片多孔墊片轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)各組件及其位置轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)各組件及其位置321.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, 準(zhǔn)備準(zhǔn)備2個干凈的小燒杯；個干凈的小燒杯；2.把玻璃

27、板在灌膠支架上固定好，放好密封條和隔離板把玻璃板在灌膠支架上固定好，放好密封條和隔離板, 固定玻璃板時，兩邊用力一固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板定要均勻，防止夾壞玻璃板;3.按照下表配制按照下表配制12分離膠與分離膠與4濃縮膠；濃縮膠；4.樣品的制備：樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別與樣品的制備：樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別與5倍上樣緩沖液按倍上樣緩沖液按5：1的比例混勻，并在的比例混勻，并在100度度沸水浴中煮沸水浴中煮5min，取出待用；，取出待用；SDS-PAGE凝膠的制作凝膠的制作33分離膠分離膠(12%)濃縮膠濃縮膠(4%)超純水超純水3.3 ml3 ml30% Acr/Bis4 ml0.

28、66mlBuffer1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml10% SDS100 l50 l10% Ap50 l25 lTEMED5 l5 l 凝膠的成分凝膠的成分聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套345.按比例配好分離膠按比例配好分離膠,用移液管快速加入，大約用移液管快速加入，大約5厘米左右厘米左右,之后加少許蒸餾水（或異丙醇之后加少許蒸餾水（或異丙醇除泡），靜置至膠凝固；除泡），靜置至膠凝固；凝膠配制過程要迅速凝膠配制過程要迅速, 催化劑催化劑TEMED要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無法注膠。注膠過要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無法注膠。注膠過程程 最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡；最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡；水封的目的：保持分離膠上沿平直，排氣泡；水封的目的：保持分離膠上沿平直，排氣泡；膠凝好的標(biāo)志：膠與水層之間形成清晰的界面；膠凝好的標(biāo)志：膠與水層之間形成清晰的界面；6.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入縮膠至離邊緣倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)