蛋白質(zhì)的分離純化剖析

1、 第一節(jié)第一節(jié) 引言引言n蛋白質(zhì)存在于一切生物體中蛋白質(zhì)存在于一切生物體中,是非常重要的是非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者,擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)、防御、擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)、防御、調(diào)控及記憶、識(shí)別等多種生理功能。調(diào)控及記憶、識(shí)別等多種生理功能。 第二章第二章 蛋白質(zhì)分離純化原理與技術(shù)蛋白質(zhì)分離純化原理與技術(shù)一、分離純化的意義一、分離純化的意義從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)從生物材料中分離制備蛋白質(zhì),研究其結(jié)構(gòu)與研究其結(jié)構(gòu)與功能功能,對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律,闡明生命現(xiàn)象闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。的本質(zhì)有重

2、大意義。工業(yè)生產(chǎn)的需要工業(yè)生產(chǎn)的需要:食品、發(fā)酵、紡織、制革等食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)工業(yè),需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。醫(yī)療的需要醫(yī)療的需要:如用豬胰島素治療糖尿病。如用豬胰島素治療糖尿病?；蚬こ痰男枰蚬こ痰男枰?、分離純化的要求二、分離純化的要求1 1、純度、純度: :主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究蛋白和一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)為研究蛋白和一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu), ,一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶

3、和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的酶制劑酶制劑, ,都要求均一都要求均一; ;工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑質(zhì)制劑, ,達(dá)到一定純度即可達(dá)到一定純度即可, ,不要求均一。不要求均一。2 2、活性、活性: :要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài), ,有高度的生物活有高度的生物活性。性。3 3、收率、收率: :希望收率越高越好希望收率越高越好, ,但在分離純化過(guò)程中總有不但在分離純化過(guò)程中總有不少損失。而且提純步驟越多少損失。而且提純步驟越多, ,損失越大。損失越大。三、分離純化的一般程序三、分離純化的一般程序 蛋白

4、質(zhì)分子的分離純化一般可分為以下幾個(gè)階段蛋白質(zhì)分子的分離純化一般可分為以下幾個(gè)階段: 材料的選擇和預(yù)處理材料的選擇和預(yù)處理 破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r(shí)還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離）破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r(shí)還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離） 分離純化分離純化:包括粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離包括粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離 其中前兩個(gè)階段為分離純化的前處理。其中前兩個(gè)階段為分離純化的前處理。第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)分離純化的前處理蛋白質(zhì)分離純化的前處理一、材料的選擇與預(yù)處理一、材料的選擇與預(yù)處理n選擇材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。工業(yè)生產(chǎn)上注意選選擇材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā９I(yè)生產(chǎn)上注意選擇含量高、來(lái)源豐富、易獲得、制備工藝簡(jiǎn)單、成本擇含量

5、高、來(lái)源豐富、易獲得、制備工藝簡(jiǎn)單、成本低的動(dòng)植物組織或微生物做原料?？蒲羞x材則無(wú)需考低的動(dòng)植物組織或微生物做原料。科研選材則無(wú)需考慮上述問(wèn)題慮上述問(wèn)題,只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯?。只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯?。n實(shí)驗(yàn)材料選定后實(shí)驗(yàn)材料選定后,常常需要進(jìn)行預(yù)處理常常需要進(jìn)行預(yù)處理,如動(dòng)物材料需要如動(dòng)物材料需要除去一些與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織除去一些與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織;植物種子植物種子需要除殼需要除殼;微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開(kāi)。另外微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開(kāi)。另外,必須必須盡可能保持材料的新鮮盡可能保持材料的新鮮,盡快加工處理。若不立即進(jìn)行盡快加工處理。若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或加工實(shí)驗(yàn)或

6、加工,應(yīng)冷凍保存。應(yīng)冷凍保存。二、細(xì)胞的破碎二、細(xì)胞的破碎n分離提取某一生物大分子分離提取某一生物大分子,首先要求生物大分首先要求生物大分子從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出子從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)來(lái),并保持原來(lái)的天然狀態(tài)并保持原來(lái)的天然狀態(tài),不丟生物活性。因不丟生物活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但若此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物泌物,則不必進(jìn)行組織細(xì)胞的破碎。則不必進(jìn)行組織細(xì)胞的破碎。n組織細(xì)胞的破碎方法很多組織細(xì)胞的破碎方法很多,不同的實(shí)驗(yàn)規(guī)模不同的實(shí)驗(yàn)規(guī)模,不

7、不同的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求同的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求,使用的破碎方法和使用的破碎方法和條件也不同條件也不同。v一般動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎一般動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。或用超聲波處理破碎。v植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁,一般常用與石英砂和適當(dāng)?shù)奶嵋话愠Ｓ门c石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能達(dá)取液一起研磨的方法破碎或用纖維素酶處理也能達(dá)到目的。到目的。v細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難,因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁的骨因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)菌細(xì)

8、胞壁的骨架實(shí)際上是一借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分架實(shí)際上是一借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子子,非常堅(jiān)韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英非常堅(jiān)韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。三、細(xì)胞器的分離三、細(xì)胞器的分離n細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),植物細(xì)胞植物細(xì)胞還有葉綠體。還有葉綠體。n如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大分子如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大分子,為了為了防止其他細(xì)胞組分中的物質(zhì)對(duì)制備物的干擾或污染防止其他細(xì)胞組分中的物

9、質(zhì)對(duì)制備物的干擾或污染,還需還需先將細(xì)胞器分離出來(lái)先將細(xì)胞器分離出來(lái),然后在某一細(xì)胞器中分離某一物質(zhì)。然后在某一細(xì)胞器中分離某一物質(zhì)。n細(xì)胞器的分離一般采用細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法差速離心法,即將破碎后的細(xì)胞在即將破碎后的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心,常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞組分按質(zhì)量大小的不同檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞組分按質(zhì)量大小的不同,經(jīng)經(jīng)過(guò)不同速度的離心后過(guò)不同速度的離心后,沉降于離心管的不同部位沉降于離心管的不同部位,經(jīng)多次分經(jīng)多次分步離心后步離心后,即可獲得所需組分。即可獲得所需組分。四、提取四、提取

10、n組織細(xì)胞破碎過(guò)程中組織細(xì)胞破碎過(guò)程中,大量的胞內(nèi)酶及細(xì)大量的胞內(nèi)酶及細(xì)胞內(nèi)含物被釋放出來(lái)胞內(nèi)含物被釋放出來(lái),必須立即將其置于必須立即將其置于一定條件下和溶劑中一定條件下和溶劑中,讓制備物充分溶解讓制備物充分溶解,并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài)并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài),避免因長(zhǎng)避免因長(zhǎng)久放置造成制備物的分解破壞久放置造成制備物的分解破壞,這就是這就是提提取取。1 1、蛋白質(zhì)的提取、蛋白質(zhì)的提取n大多數(shù)蛋白質(zhì)均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸大多數(shù)蛋白質(zhì)均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中溶液中,故蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提取為故蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提取為主。通常采用類(lèi)似生理?xiàng)l件下的緩沖液主。通常采用

11、類(lèi)似生理?xiàng)l件下的緩沖液,如如20-20-5050m mol/Lm mol/L的磷酸鹽緩沖液（的磷酸鹽緩沖液（pH7.0-7.5pH7.0-7.5）或或0.10.1mol/L Tris-HClmol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0pH7.5-8.0）緩沖液作提緩沖液作提取液。取液。n對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性較多的蛋白質(zhì)較多的蛋白質(zhì), ,不溶于水、稀鹽、稀堿、稀酸不溶于水、稀鹽、稀堿、稀酸, ,常在提取液中加入適量的有機(jī)溶劑常在提取液中加入適量的有機(jī)溶劑, ,如乙醇、如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。丙酮、異丙醇、正丁醇等。第三節(jié)第三

12、節(jié) 蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)分離純化n從細(xì)胞中提取得到的蛋白質(zhì)往往是不純的從細(xì)胞中提取得到的蛋白質(zhì)往往是不純的,含有大量雜質(zhì)含有大量雜質(zhì),必須進(jìn)一步分離純化必須進(jìn)一步分離純化,這一這一階段可分為階段可分為粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離兩步兩步進(jìn)行。進(jìn)行。一、蛋白質(zhì)的分離純化一、蛋白質(zhì)的分離純化n蛋白質(zhì)分離純化的方法很多蛋白質(zhì)分離純化的方法很多,主要是根據(jù)蛋白分子之間特異主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異性的差異,如分子大小如分子大小,溶解度溶解度,電荷等建立起來(lái)的。電荷等建立起來(lái)的。 性質(zhì)性質(zhì) 方法方法v分子大小分子大小 透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過(guò)濾透析、超濾、密度梯度離心、凝

13、膠過(guò)濾v 溶解度溶解度 等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀v電荷電荷 電泳、離子交換層析電泳、離子交換層析v吸附性質(zhì)吸附性質(zhì) 吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）v對(duì)配體分子對(duì)配體分子 親和層析親和層析 的生物親和力的生物親和力 主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法劑沉淀等方法,使目的蛋白與其它較大量的使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(kāi)雜蛋白分開(kāi),這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)量大、既能除去大量雜質(zhì),又能濃縮蛋白質(zhì)又能濃縮蛋白質(zhì),但分

14、辨率低。但分辨率低。1 1、粗分級(jí)分離、粗分級(jí)分離（1 1）鹽析）鹽析l 向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽 （NHNH4 4) )2 2SOSO4,4,NaNa2 2SOSO4 4,使使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀, ,這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析。這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析。l 鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí), ,鹽離子與水分子作用鹽離子與水分子作用, ,使使水的活度降低水的活度降低, ,原來(lái)溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的原來(lái)溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水水化水, ,從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用從而降低蛋白質(zhì)極

15、性基團(tuán)與水分子之間的作用, ,破破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層, ,使蛋白聚集沉淀。同時(shí)鹽離子使蛋白聚集沉淀。同時(shí)鹽離子可以中和蛋白質(zhì)的表面電荷可以中和蛋白質(zhì)的表面電荷, ,也促進(jìn)蛋白的沉淀也促進(jìn)蛋白的沉淀。l 不同的蛋白質(zhì)分子不同的蛋白質(zhì)分子, ,由于其分子表面的極由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類(lèi)、數(shù)目以及排布的不同性基團(tuán)的種類(lèi)、數(shù)目以及排布的不同, ,其水化其水化層厚度不同層厚度不同, ,故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣, ,因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度, ,可以使不同的蛋可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如白質(zhì)分別沉淀。如: :血清

16、血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 450%50%飽和度飽和度100%100%飽和飽和析出析出析出析出分段鹽析分段鹽析（2 2）等電點(diǎn)沉淀）等電點(diǎn)沉淀n蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì), ,其溶解度與其凈電荷數(shù)其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)量有關(guān), ,隨溶液隨溶液pHpH變化而變化。在溶液變化而變化。在溶液pHpH值等值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí), ,蛋白質(zhì)的溶解度最小。蛋白質(zhì)的溶解度最小。n不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn), ,因此通過(guò)調(diào)節(jié)因此通過(guò)調(diào)節(jié)溶液溶液pHpH到目的蛋白的等電點(diǎn)到目的蛋白的等電點(diǎn), ,可使之沉淀而與可使之

17、沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開(kāi)其它蛋白質(zhì)分開(kāi), ,從而除去大量雜蛋白。從而除去大量雜蛋白。（3 3）有機(jī)溶劑法）有機(jī)溶劑法n與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。n有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個(gè)有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個(gè):v降低水的降低水的介電常數(shù)介電常數(shù),使蛋白質(zhì)分子表面可解離使蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱基團(tuán)的離子化程度減弱,水化程度降低水化程度降低,促進(jìn)了促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。v是極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水是極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)

18、爭(zhēng)奪水化水,而使蛋而使蛋白質(zhì)分子沉淀。白質(zhì)分子沉淀。n室溫下室溫下,這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀,而而且伴隨著變性。若預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻且伴隨著變性。若預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻,然后然后在不斷攪拌下將其逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中在不斷攪拌下將其逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中,防防止有機(jī)溶劑局部濃度過(guò)高止有機(jī)溶劑局部濃度過(guò)高,則在很大程度上解則在很大程度上解決變性問(wèn)題。決變性問(wèn)題。 不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同, ,發(fā)生沉淀發(fā)生沉淀需要的有機(jī)溶劑濃度不同需要的有機(jī)溶劑濃度不同, ,因此可利用不同濃因此可利用不同濃度的有機(jī)溶劑分離不同的蛋白質(zhì)。度的有機(jī)溶劑

19、分離不同的蛋白質(zhì)。2 2、細(xì)分級(jí)分離、細(xì)分級(jí)分離n一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級(jí)后一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級(jí)后,體積較小體積較小,雜質(zhì)雜質(zhì)大部分被除去。進(jìn)一步提純大部分被除去。進(jìn)一步提純,通常使用高分辨通常使用高分辨率的率的柱層析及電泳柱層析及電泳方法。方法。n常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。析、疏水吸附層析、親和層析。n常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。聚焦電泳。n另外另外,結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一,制制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)

20、構(gòu)分析之用。備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。 酶的活力測(cè)定酶的活力測(cè)定n在酶的制備過(guò)程中在酶的制備過(guò)程中, ,每一步驟都應(yīng)測(cè)定留用以及每一步驟都應(yīng)測(cè)定留用以及準(zhǔn)備棄去部分中所含酶的總活力和比活力準(zhǔn)備棄去部分中所含酶的總活力和比活力, ,以了以了解經(jīng)過(guò)某一步驟后酶的回收率、純化倍數(shù)解經(jīng)過(guò)某一步驟后酶的回收率、純化倍數(shù), ,從而從而決定這一步的取舍。決定這一步的取舍。n總活力總活力= =活力單位活力單位/ /mlml酶液總體積（酶液總體積（mlml）n比活力比活力= =總活力單位數(shù)總活力單位數(shù)/ /總蛋白（氮）總蛋白（氮）mgmgn純化倍數(shù)純化倍數(shù)= =每次比活力每次比活力/ /第一次比活力

21、第一次比活力n回收率（產(chǎn)率）回收率（產(chǎn)率）= =（每次總活力（每次總活力/ /第一次總活力）第一次總活力）100%100%第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)純度鑒定蛋白質(zhì)純度鑒定n生物大分子經(jīng)過(guò)分離提純生物大分子經(jīng)過(guò)分離提純, ,最后還要鑒定制品的純度。最后還要鑒定制品的純度。n蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定通常采用的方法有蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定通常采用的方法有:SDS-:SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉降烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉降分析法、免疫化學(xué)法、分析法、免疫化學(xué)法、N-N-末端氨基酸分析法等。末端氨基酸分析法等。v純的蛋白質(zhì)在一定條件下進(jìn)行電泳純的蛋白質(zhì)在一定條

22、件下進(jìn)行電泳, ,將以單一的速度移將以單一的速度移動(dòng)動(dòng), ,它的電泳圖譜只出現(xiàn)一條帶。同樣純的蛋白質(zhì)在離它的電泳圖譜只出現(xiàn)一條帶。同樣純的蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中心場(chǎng)中, ,應(yīng)以單一的沉降速度移動(dòng)。應(yīng)以單一的沉降速度移動(dòng)。v選用任何單獨(dú)一種鑒定方法都不能最后確定蛋白質(zhì)的選用任何單獨(dú)一種鑒定方法都不能最后確定蛋白質(zhì)的純度純度, ,必須同時(shí)采用必須同時(shí)采用2-32-3種不同的方法才能確定。種不同的方法才能確定。第五節(jié)第五節(jié) 蛋白質(zhì)的層析分離蛋白質(zhì)的層析分離n應(yīng)用廣泛。特征應(yīng)用廣泛。特征: :有一個(gè)固定相和一個(gè)流動(dòng)相。有一個(gè)固定相和一個(gè)流動(dòng)相。由于待分離的各種物質(zhì)在這兩個(gè)相分配系數(shù)不由于待分離的各種物質(zhì)在這

23、兩個(gè)相分配系數(shù)不同同, ,當(dāng)兩個(gè)相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)當(dāng)兩個(gè)相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí), ,這些物質(zhì)在兩相間這些物質(zhì)在兩相間反復(fù)多次分配反復(fù)多次分配, ,結(jié)果使其相互分開(kāi)。結(jié)果使其相互分開(kāi)。n根據(jù)兩相的狀態(tài)根據(jù)兩相的狀態(tài), ,層析法可分為層析法可分為: :氣相層析和液氣相層析和液相層析相層析; ;按層析原理可分為按層析原理可分為: :吸附層析、分配層吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和親和層析析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和親和層析等。按操作形式分為等。按操作形式分為: :柱層析、薄層層析、紙柱層析、薄層層析、紙層析等。層析等。n 分配系數(shù)分配系數(shù): k=C: k=Cs s/C/Cm m , ,物質(zhì)在

24、固定相與流動(dòng)相濃度之物質(zhì)在固定相與流動(dòng)相濃度之比。質(zhì)量分配系數(shù)比。質(zhì)量分配系數(shù):D=k:D=kVs / Vm , Vs , Vm 為固定相為固定相和流動(dòng)相的體積。和流動(dòng)相的體積。一、層析的一般原理一、層析的一般原理 3216168816812412412228 如果柱頂加入如果柱頂加入32mg32mg樣品樣品, ,樣品樣品的質(zhì)量分配系數(shù)的質(zhì)量分配系數(shù)D D為為1 1, ,即樣品在兩即樣品在兩相中是等量分配。經(jīng)過(guò)相中是等量分配。經(jīng)過(guò)5 5層的平衡層的平衡分配后分配后, ,樣品在柱的分配情況見(jiàn)圖。樣品在柱的分配情況見(jiàn)圖。樣品集中在中間。如果樣品集中在中間。如果D1D1D1, ,樣品集樣品集中在中間

25、偏下。中在中間偏下。 離子交換層析離子交換層析( (IEX)IEX)是根據(jù)電荷來(lái)分離分子的。是根據(jù)電荷來(lái)分離分子的。 離子交換劑是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將解離基團(tuán)引入到惰性支持物離子交換劑是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將解離基團(tuán)引入到惰性支持物上形成的。分為上形成的。分為: 陽(yáng)離子交換劑陽(yáng)離子交換劑: 解離基團(tuán)帶負(fù)電解離基團(tuán)帶負(fù)電, 結(jié)合陽(yáng)離子結(jié)合陽(yáng)離子; 陰離子交換劑陰離子交換劑: 解離基團(tuán)帶正電解離基團(tuán)帶正電, 結(jié)合陰離。結(jié)合陰離。 蛋白質(zhì)分子是兩性物質(zhì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子是兩性物質(zhì)。當(dāng)pHpHpIpI,分子帶負(fù)電分子帶負(fù)電,可結(jié)合陰可結(jié)合陰離子交換劑離子交換劑;當(dāng)當(dāng)pHpIpHpI,分子帶正電分子帶正電,可結(jié)合陽(yáng)離子交

26、換劑。如陽(yáng)離可結(jié)合陽(yáng)離子交換劑。如陽(yáng)離子交換劑與帶正電蛋白質(zhì)分子之間有如下平衡子交換劑與帶正電蛋白質(zhì)分子之間有如下平衡: 二、離子交換層析二、離子交換層析（一）基本原理（一）基本原理 帶電蛋白質(zhì)分子與交換劑的結(jié)合是可逆的。帶電蛋白質(zhì)分子與交換劑的結(jié)合是可逆的。 由于由于pHpH可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和帶電量可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和帶電量,鹽離子會(huì)影響蛋鹽離子會(huì)影響蛋白質(zhì)在交換劑上吸附。所以用白質(zhì)在交換劑上吸附。所以用一定濃度的鹽溶液或一定一定濃度的鹽溶液或一定pH 的緩沖液的緩沖液就可把蛋白質(zhì)就可把蛋白質(zhì)從離子交換劑上從離子交換劑上洗脫下來(lái)。洗脫下來(lái)。對(duì)多組分混合物對(duì)多組分混合物,每種分子所帶

27、的電荷不同每種分子所帶的電荷不同,因此因此,可用不可用不同的離子強(qiáng)度同的離子強(qiáng)度 或不同的或不同的pHpH溶液將蛋白質(zhì)從交換劑上一溶液將蛋白質(zhì)從交換劑上一一一洗脫下來(lái)。洗脫下來(lái)。 （二）離子交換劑的基本類(lèi)型（二）離子交換劑的基本類(lèi)型 根據(jù)可供交換的離子的性質(zhì)根據(jù)可供交換的離子的性質(zhì),離子交換劑可被分為陽(yáng)離子交換劑可被分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。若按酸堿性的強(qiáng)弱離子交換劑和陰離子交換劑。若按酸堿性的強(qiáng)弱,又可又可分為強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、弱酸、弱堿幾種類(lèi)型的離子交換劑。分為強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、弱酸、弱堿幾種類(lèi)型的離子交換劑。 強(qiáng) 酸 和 強(qiáng) 堿 型 交 換 劑 能 在 較 廣 泛 的強(qiáng) 酸 和 強(qiáng) 堿 型 交

28、 換 劑 能 在 較 廣 泛 的 pH范 圍 內(nèi)范 圍 內(nèi)（pH212）完全解離。弱酸型交換劑在低于完全解離。弱酸型交換劑在低于pH4、弱堿型交換劑在高于弱堿型交換劑在高于pH9就難于解離就難于解離,因而失去交換能因而失去交換能力。因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)在力。因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)在pH68之間穩(wěn)定之間穩(wěn)定,所以常用弱酸所以常用弱酸或弱堿型交換劑?；蛉鯄A型交換劑。離子交換基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)離子交換基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)類(lèi)型類(lèi)型名稱(chēng)名稱(chēng)結(jié)構(gòu)式結(jié)構(gòu)式性質(zhì)性質(zhì)DEAE二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)2弱堿性弱堿性QAE季胺乙基季胺乙基(quatern

29、ary aminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3強(qiáng)堿性強(qiáng)堿性Q季胺季胺(quaternary amine)-CH2-N+-(CH3)3 強(qiáng)堿性強(qiáng)堿性CM羧甲基羧甲基(carboxymehyl)-O-CH2-COO -弱酸性弱酸性SE磺乙基磺乙基(sulfoethyl)-O-CH2CH2-SO3-強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性SP磺丙基磺丙基(sulfopropyl)-O-CH2-CH2-CH2-SO3-強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性P磷酸基磷酸基(phosphate)-O-PO3-中酸性中酸性S磺酸基磺酸基(sulfonate)-CH2-SO3-強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性 可用來(lái)作為交換劑支持物的物質(zhì)種類(lèi)較多。早期用于

30、分離可用來(lái)作為交換劑支持物的物質(zhì)種類(lèi)較多。早期用于分離氨基酸、小肽和其它小分子物質(zhì)的離子交換樹(shù)脂的支持物是氨基酸、小肽和其它小分子物質(zhì)的離子交換樹(shù)脂的支持物是聚苯聚苯乙烯類(lèi)乙烯類(lèi)。 分離蛋白質(zhì)的常用的親水性支持物。有三大類(lèi)分離蛋白質(zhì)的常用的親水性支持物。有三大類(lèi):纖維素、葡纖維素、葡聚糖凝膠聚糖凝膠(sephadex)、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠(sepharose)和合成凝膠和合成凝膠(Trisacryl和和Fractogel)。1、離子交換纖維素、離子交換纖維素 離子交換纖維素是以纖維素做支持介質(zhì)的。具有松散的親離子交換纖維素是以纖維素做支持介質(zhì)的。具有松散的親水性網(wǎng)絡(luò)水性網(wǎng)絡(luò),較大的表面積較大

31、的表面積,吸附容量大吸附容量大,通透性好。根據(jù)離子交換通透性好。根據(jù)離子交換纖維素所含離子交換基團(tuán)的性質(zhì)可分為強(qiáng)酸、強(qiáng)堿型和弱酸、纖維素所含離子交換基團(tuán)的性質(zhì)可分為強(qiáng)酸、強(qiáng)堿型和弱酸、弱堿型?，F(xiàn)將常用的離子交換纖維素列于下表中。弱堿型。現(xiàn)將常用的離子交換纖維素列于下表中。常用的離子交換纖維素常用的離子交換纖維素離子類(lèi)型 解 離 基 團(tuán)特 點(diǎn)DEAE-OCH2CH2N+(C2H5) 在 pH8.6 應(yīng)用 陰離子陰離子解離基團(tuán)解離基團(tuán)交換交換摩爾摩爾(m mol/g) 特點(diǎn)特點(diǎn)DEAEOCH2CH2N(C2H5)0.11.1 在在pH4應(yīng)應(yīng)用用POPO3H20.77.4酸性較強(qiáng)酸性較強(qiáng)SEOCH2

32、CH2SO3H0.20.3強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性 在在Sephadex上接上某種離子交換基團(tuán)。這上接上某種離子交換基團(tuán)。這種凝膠既有離子交換劑的性質(zhì)種凝膠既有離子交換劑的性質(zhì),又有分子篩效應(yīng)。又有分子篩效應(yīng)。因此因此,其分離能力比單純的層析凝膠或離子交換其分離能力比單純的層析凝膠或離子交換劑好。葡聚糖凝膠離子交換劑的交換量比相應(yīng)劑好。葡聚糖凝膠離子交換劑的交換量比相應(yīng)的纖維素離子交換劑大的纖維素離子交換劑大,如如DEAESephadex的的交換量大約是交換量大約是DEAE纖維素的纖維素的3.55.0倍。倍。2、離子交換葡聚糖凝膠（、離子交換葡聚糖凝膠（Sephadex）葡聚糖凝膠離子交換劑的性質(zhì)葡聚糖凝

33、膠離子交換劑的性質(zhì) 類(lèi)別類(lèi)別離子交換基團(tuán)離子交換基團(tuán)床體床體積積ml/g分離范圍分離范圍(Mr)交換量交換量總交換容量總交換容量(m mol/g) 強(qiáng)陽(yáng)離子交強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑換劑SESephadex C25 C50-CH2CH2SO3H5932383104- 21053104-21052.02-52.02-5 SPSephadex C25 C50-CH2CH2CH2SO3H 2.30.3 弱陽(yáng)離子交弱陽(yáng)離子交換劑換劑CMSephadex C25 C50-O-CH2COOH61032403104-21053104-2105 4.50.5 強(qiáng)陰離子交換劑強(qiáng)陰離子交換劑QAESephadex A25

34、A505830403104-21053104-2105 3.04.0 弱陰離子交換劑弱陰離子交換劑DEAESephadex A25 A50-C2H4N+(C2H5)2H592583 3104-21053104-21053.54.5 類(lèi)別類(lèi)別離子交換基團(tuán)離子交換基團(tuán)床體積床體積ml/g分離范圍分離范圍(Mr)交換量交換量總交換容量總交換容量(m mol/g) -O-C2H4N+(C2H5)2 將各種離子基團(tuán)引入到交聯(lián)瓊脂糖將各種離子基團(tuán)引入到交聯(lián)瓊脂糖(Speharose CL)和大孔合成凝膠和大孔合成凝膠(Trisacryl或或Fractogel)上上,則則形成一系列離子交換劑。這類(lèi)交換劑即堅(jiān)

35、硬、吸附形成一系列離子交換劑。這類(lèi)交換劑即堅(jiān)硬、吸附容量大容量大,形狀球形形狀球形,能維持較好的流速及分辨率。能維持較好的流速及分辨率。3、交聯(lián)凝膠離子交換劑、交聯(lián)凝膠離子交換劑（三）層析條件的選擇（三）層析條件的選擇1、離子交換劑的選擇、離子交換劑的選擇 選擇離子交換劑之前要了解樣品的性質(zhì)選擇離子交換劑之前要了解樣品的性質(zhì):熱穩(wěn)熱穩(wěn)定性、帶電情況、定性、帶電情況、pH和鹽濃度對(duì)其活性和溶解度的和鹽濃度對(duì)其活性和溶解度的影響。一般情況下影響。一般情況下,帶負(fù)電的物質(zhì)用陰離子交換劑帶負(fù)電的物質(zhì)用陰離子交換劑,反反之之,則用陽(yáng)離子交換劑。實(shí)驗(yàn)室中最廣泛使用的是則用陽(yáng)離子交換劑。實(shí)驗(yàn)室中最廣泛使用的

36、是DEAE和和CM 交換劑。交換劑。 2、交換顆粒大小的選擇、交換顆粒大小的選擇 粒子大小主要影響分辨率和流速。粗粒子大小主要影響分辨率和流速。粗粒子粒子:交換容量小、間隙大、分辨率底、流速交換容量小、間隙大、分辨率底、流速較快。細(xì)粒子較快。細(xì)粒子:分辨力高、交換容量大但是分辨力高、交換容量大但是流速慢。流速慢。3、層析緩沖液的選擇、層析緩沖液的選擇 選擇正確的緩沖液可獲得較好的層析效果。因?yàn)檫x擇正確的緩沖液可獲得較好的層析效果。因?yàn)殡x子相互作用取決于離子相互作用取決于pH,而維持介質(zhì)的而維持介質(zhì)的pH,通常是由緩?fù)ǔＪ怯删彌_液來(lái)實(shí)現(xiàn)的。所用緩沖液的種類(lèi)、沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)的。所用緩沖液的種類(lèi)、pH大

37、小大小,決定決定 待分待分離組分的穩(wěn)定性和溶解度。離組分的穩(wěn)定性和溶解度。 為避免緩沖液的離子參與離子交換過(guò)程為避免緩沖液的離子參與離子交換過(guò)程,采用緩沖采用緩沖液所帶的電荷應(yīng)與離子交換劑所帶電荷相同。使用陽(yáng)液所帶的電荷應(yīng)與離子交換劑所帶電荷相同。使用陽(yáng)離子交換劑時(shí)離子交換劑時(shí),要用陰離子型緩沖液（磷酸、醋酸等）要用陰離子型緩沖液（磷酸、醋酸等）;使用陰離子交換劑時(shí)要用陽(yáng)離子型緩沖液（使用陰離子交換劑時(shí)要用陽(yáng)離子型緩沖液（Tris、胺鹽、胺鹽、吡啶等）。吡啶等）。 要得到好的分離效果要得到好的分離效果,層析時(shí)要注意層析柱的高度和層析時(shí)要注意層析柱的高度和體積體積;上樣量的大小上樣量的大小;洗脫

38、液體積洗脫液體積;洗脫速度洗脫速度;分級(jí)物的收分級(jí)物的收集量。集量。1、柱床體積、柱床體積:至少要比結(jié)合所有樣品所需要的要大至少要比結(jié)合所有樣品所需要的要大25倍。離子交換層析所用的柱不用太長(zhǎng)倍。離子交換層析所用的柱不用太長(zhǎng),以便縮短操作時(shí)以便縮短操作時(shí)間。間。2、樣品、樣品pH 和離子強(qiáng)度和離子強(qiáng)度:與起始緩沖液具有相同的與起始緩沖液具有相同的pH和離和離子強(qiáng)度。子強(qiáng)度。3、洗脫液體積和洗脫梯度的形狀、洗脫液體積和洗脫梯度的形狀:對(duì)柱的分辨率影響很大。對(duì)柱的分辨率影響很大。洗脫可用恒定組成的緩沖液來(lái)完成（簡(jiǎn)單洗脫）也可洗脫可用恒定組成的緩沖液來(lái)完成（簡(jiǎn)單洗脫）也可用改變用改變pH或鹽濃度或鹽

39、濃度,或二者均改變的洗脫液來(lái)完成?；蚨呔淖兊南疵撘簛?lái)完成。pH和鹽濃度的改變又分為連續(xù)改變（梯度洗脫）和不和鹽濃度的改變又分為連續(xù)改變（梯度洗脫）和不連續(xù)改變（階段洗脫）連續(xù)改變（階段洗脫）。（四）柱層析技術(shù)（四）柱層析技術(shù) 交換劑的處理就是將交換劑轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合分離目的的離交換劑的處理就是將交換劑轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合分離目的的離子類(lèi)型。一般包括除雜質(zhì)、溶脹子類(lèi)型。一般包括除雜質(zhì)、溶脹,除細(xì)粒和改型。改型就除細(xì)粒和改型。改型就是用適當(dāng)?shù)碾x子平衡是用適當(dāng)?shù)碾x子平衡,使交換劑帶上希望的離子。陽(yáng)離子使交換劑帶上希望的離子。陽(yáng)離子和陰離子交換劑最后分別為和陰離子交換劑最后分別為Na和和Cl型是最穩(wěn)定形式。型是最

40、穩(wěn)定形式。4、洗脫速度、洗脫速度:太快或太慢都會(huì)降低柱的分辨率。太快或太慢都會(huì)降低柱的分辨率。5、分級(jí)物收集量、分級(jí)物收集量:關(guān)系到能否充分代表層析柱的分辨關(guān)系到能否充分代表層析柱的分辨率。一般總洗脫體積在率。一般總洗脫體積在5002000ml時(shí)時(shí),每管收集每管收集510ml（五）離子交換劑的處理和再生（五）離子交換劑的處理和再生 離子交換劑價(jià)格較貴離子交換劑價(jià)格較貴,用后再經(jīng)過(guò)再生處理用后再經(jīng)過(guò)再生處理,可反復(fù)可反復(fù)多次使用。處理時(shí)避免用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿長(zhǎng)時(shí)間浸泡多次使用。處理時(shí)避免用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿長(zhǎng)時(shí)間浸泡,以防以防載體的糖鏈結(jié)構(gòu)遭水解破壞。載體的糖鏈結(jié)構(gòu)遭水解破壞。 劑型劑型處理用的酸或處理用的酸

41、或堿濃度堿濃度浸泡時(shí)間浸泡時(shí)間纖維素纖維素 SephadexSepharose合成凝膠合成凝膠0.5M HCl或或NaOH(含含0.5M NaCl)0.1M HCl或或NaOH(含含1M NaCl)1M NaAc (pH3.0)或或0.1M NaOH(含含1M NaCl)0.51.0M HCl或或NaOH(含含1M NaCl)34h0.5h可在柱中再可在柱中再生生長(zhǎng)時(shí)間浸泡長(zhǎng)時(shí)間浸泡無(wú)影響無(wú)影響各類(lèi)離子交換劑的再生條件各類(lèi)離子交換劑的再生條件 血清蛋白常用離子交換層析分離。血清蛋白常用離子交換層析分離。IgG可用可用QAESephadex A50或或DEAESephadex A50分離?，F(xiàn)在臨床上有重要用途的許多血清蛋白分離。現(xiàn)在臨床上有重要用途的許多血清蛋白,如白蛋白如白蛋白,factor IX復(fù)合物和專(zhuān)一性免疫球蛋白已復(fù)合物和專(zhuān)一性免疫球蛋白已用離子交換層析大規(guī)模生產(chǎn)。用離子交換層析大規(guī)模生產(chǎn)。（六）離子交換層系的應(yīng)用實(shí)例（六）離子交換層系的應(yīng)用實(shí)例 凝膠層析又稱(chēng)凝膠滲透層析、排阻層析凝膠層析又