核磁共振_質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展

1、NA representational difference analysis J .DNA Cell Biol ,2002,21(11:7712780.8Kmowles L M ,Milner J A.Diallyl disulfide induces ER K phos 2phorylation and alters gene expression profiles in human colon tumor cellsJ .J Nutr ,2003,133(9:290122906.9Chung J G ,Lu HF ,Yeh CC ,et al .Inhibition of N 2acet

2、yltrans 2ferase activity and gene expression in human colon cancer cell lines by diallyl sulfide J .Food Chem Toxicol ,2004,42(2:1952202.10王玉英,程何祥,張殿新,等.Ang 對人心房細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響及大蒜素的拮抗作用J .心電學(xué)雜志,2005,24(2:84286.11史春志,谷翔,馮義柏,等.大蒜素對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的藥物預(yù)適應(yīng)及抗凋亡作用J .中華實(shí)用中西醫(yī)雜志,2005,18(14:3202323.12蔡飛,李彩蓉,吳基良,等.大蒜素對

3、大鼠局灶性腦缺血后熱休克蛋白的影響J .醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2005,24(3:1832184.13鄭燕華,陳崇宏.大蒜素對大鼠急性腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究J .中國藥理學(xué)通報(bào),2004,20(7:8212823.14劉浩,崔美芝,董娟.大蒜素抗氧化延緩衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究J .中國老年學(xué)雜志,2006,26(2:2522253.15Bakri IM ,Douglas CWI.Inhibitory effect of garlic extract on o 2ral bacteria J .Archives of Oral Biology ,2005,50(6:6452651.16張志勉,高海青,魏

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5、2氣相色譜法測定大蒜素注射液的含量J .中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,36(1:90291.收稿日期2006209222作者簡介駱澤宇,男,大學(xué),主管藥師,電話:139*核磁共振2質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展駱澤宇(柳州市人民醫(yī)院藥劑科,廣西柳州545001摘要目的:介紹液相色譜2核磁共振2質(zhì)譜(L C 2NMR 2MS 聯(lián)用技術(shù)的基本原理及其在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展。方法:查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)和相關(guān)資料,選取有代表性的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。結(jié)果:闡述了L C 2NMR 2MS 的儀器構(gòu)造、工作模式、技術(shù)重點(diǎn),及其在生物體內(nèi)代謝物和天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定方面的典型應(yīng)用。結(jié)論:L C 2NMR 2MS 作為一項(xiàng)新的分

6、析手段,逐漸成為藥學(xué)領(lǐng)域中化合物結(jié)構(gòu)鑒定的強(qiáng)有力武器,得到越來越廣泛的應(yīng)用,具有巨大的發(fā)展前景。關(guān)鍵詞液相色譜2核磁共振2質(zhì)譜;代謝物;天然產(chǎn)物中圖分類號(hào)R 927文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼B 文章編號(hào)100125213(20070620807203在藥學(xué)研究領(lǐng)域,如何快速準(zhǔn)確的對化合物作結(jié)構(gòu)鑒定是眾多研究工作者所面對的共同難題。液相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(L C 2MS 和核磁共振光譜(NMR 是兩種較為突出的技術(shù)手段,但在單獨(dú)使用時(shí)都具有一定的局限性。而液相色譜2核磁共振光譜2質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(L C 2NMR 2MS 在單獨(dú)的L C 分離后,同時(shí)獲得MS 和NMR 數(shù)據(jù)。MS 對化合物進(jìn)行快速掃描,提供初步的結(jié)

7、構(gòu)信息;NMR 作為輔助,進(jìn)行詳細(xì)的結(jié)構(gòu)解析,提供了一種實(shí)時(shí)復(fù)合矩陣分析的模式122。本資料對L C 2NMR 2MS 聯(lián)機(jī)在線分析系統(tǒng)的儀器構(gòu)造、技術(shù)發(fā)展等做了一個(gè)全面的概括,并且詳細(xì)闡述了近10年來該技術(shù)在藥物代謝物和天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定方面的應(yīng)用。1儀器介紹1.1L C 2NMR 2MS 聯(lián)用系統(tǒng)的構(gòu)造L C 2NMR 2MS 系統(tǒng)分為并聯(lián)和串聯(lián)兩種模式。并聯(lián)模式將L C 洗脫液分為約201兩部分,大部分直接進(jìn)入NMR 流動(dòng)液槽探針,剩余少量進(jìn)入MS 離子源接口。該模式既能同時(shí)滿足NMR 的檢測靈敏度要求和MS 響應(yīng),也可避免L C 2MS 接口處產(chǎn)生的負(fù)壓損壞NMR 探針。待測物可同時(shí)被兩

8、個(gè)系統(tǒng)檢測或選擇性被其中一個(gè)所檢測。串聯(lián)模式則使樣品先經(jīng)NMR 分析后通過一個(gè)分流裝置,再進(jìn)入MS 檢測。該模式所需時(shí)間長,增大了樣品峰擴(kuò)散和保留時(shí)間漂移的可能性。但其可將MS用作單獨(dú)的質(zhì)譜分析而不會(huì)影響NMR 檢測,常用于連續(xù)流動(dòng)模式的NMR 檢測。安裝儀器時(shí),所有檢測器都應(yīng)位于距NMR 探針磁場區(qū)域5個(gè)高斯線之外,因?yàn)楦叽艌鰰?huì)大大減弱各種檢測器的響應(yīng)和靈敏度,尤其是MS 檢測器。1.2L C 2NMR 的工作模式L C 2NMR 系統(tǒng)主要有兩種工作模式:連續(xù)流動(dòng)模式和停止流動(dòng)模式。連續(xù)流動(dòng)模式是讓L C 洗脫液以一定速率連續(xù)進(jìn)入NMR 流動(dòng)液槽探針,獲得一系列連續(xù)的光譜數(shù)據(jù)。該模式下NMR

9、 數(shù)據(jù)采集時(shí)間有限,因此要求樣品組分有較高的響應(yīng)?？赏ㄟ^降低流動(dòng)相流速,增加測量時(shí)間來提高檢測靈敏度。隨色譜峰在流動(dòng)液槽中位置不同,停止流動(dòng)模式又分為直接停流模式和循環(huán)儲(chǔ)存模式。直接停流模式是在目標(biāo)色譜峰最高點(diǎn)進(jìn)入NMR 流動(dòng)液槽中心位置時(shí),流動(dòng)相停止并進(jìn)行NMR 采樣,是目前應(yīng)用最多的一種模式,但使用時(shí)可能因流動(dòng)相停止而造成色譜峰擴(kuò)散和響應(yīng)減弱,以及高濃度物質(zhì)引起的記憶效應(yīng)。循環(huán)儲(chǔ)存模式則將L C 分離后的色譜峰儲(chǔ)存在毛細(xì)管回路中,至分離全部完成后再進(jìn)行NMR 檢測。該模式不中斷色譜過程,并且可對各個(gè)色譜峰按任意順序進(jìn)行檢測。但一些成分可能因長時(shí)間儲(chǔ)存發(fā)生降解或者異構(gòu)化,影響結(jié)果準(zhǔn)確性。停流

10、模式下NMR 屬于靜態(tài)檢測,數(shù)據(jù)采集時(shí)間可隨待測物濃度作相應(yīng)的調(diào)整,對于一些質(zhì)譜響應(yīng)弱的待測物,如藥物體內(nèi)代謝物、生物標(biāo)記物、毒性物質(zhì)及天然提取物等尤為適用。1.3停流模式監(jiān)控在單獨(dú)的L C2NMR系統(tǒng)中使用停流模式時(shí),常用紫外(UV或熒光檢測器來控制液相泵的啟動(dòng)和停止,或?qū) C流出液片斷臨時(shí)保存到樣品儲(chǔ)存單元中,但其局限性在于許多化合物并無紫外吸收或熒光?，F(xiàn)今已有較為完善的MS光譜數(shù)據(jù)庫和化合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫,幫助研究者根據(jù)樣品中各成分相對分子質(zhì)量和裂解碎片快速選擇目標(biāo)色譜峰,再經(jīng)反饋的MS信號(hào)控制液相泵的停止和色譜峰片斷的儲(chǔ)存。因此L C2NMR2MS常采用并聯(lián)結(jié)構(gòu),并且選擇與NMR探針體積

11、匹配長度的毛細(xì)管來連接MS2NMR是該技術(shù)的關(guān)鍵。1.4NMR探針技術(shù)流動(dòng)液槽探針是影響NMR靈敏度的主要部件,其決定參數(shù)為直徑和體積,與待測樣品量和色譜峰面積有關(guān)。除普通探針外,相繼出現(xiàn)的冷凍探針、螺線管探針等都有其獨(dú)特的優(yōu)越性。冷凍探針的原理為當(dāng)電子元件降為-20K低溫時(shí)樣品仍處于室溫狀態(tài),此時(shí)電子噪聲顯著減弱。與普通探針相比,可將靈敏度提高34倍。螺線管探針最大的優(yōu)點(diǎn)在于其可以提供耦合常數(shù)信息,但每根毛細(xì)管柱都需匹配一個(gè)電磁線圈,成本增加,且電磁線圈與樣品太過接近也可能造成譜線變寬或分辨率減低。另有一種特殊的13C流動(dòng)探針,將電磁線圈直接安裝在玻璃管上,外面再放置一個(gè)同軸電磁線圈。該探針

12、可以削弱1H/1H耦合,并且使固定頻率變得穩(wěn)定,可在連續(xù)流動(dòng)模式中獲得普通探針難以得到的13C NMR光譜數(shù)據(jù)。1.5流動(dòng)相的兼容性和溶劑抑制流動(dòng)相是影響L C2 NMR2MS性能的另一重要因素。常用的兩相混合流動(dòng)相中,往往因水中1H質(zhì)子NMR信號(hào)太強(qiáng)而使樣品信號(hào)淹沒在溶劑噪聲中無法測得。無機(jī)鹽緩沖液和氘代有機(jī)溶劑可以解決這個(gè)問題,但無機(jī)鹽緩沖液不可用于ESI2MS(電噴霧離子源質(zhì)譜中,氘代溶劑價(jià)格昂貴,因此實(shí)際常用非氘代的甲酸、醋酸、三氟醋酸(TFA以及相應(yīng)的銨鹽。當(dāng)L C2SPE (固相萃取2NMR技術(shù)發(fā)展起來后3,只需在將待測物從SPE小柱上洗脫到NMR流動(dòng)液槽的過程中使用氘代溶劑,而在

13、L C色譜分離時(shí)使用非氘代流動(dòng)相,解決了氘代溶劑的高昂成本問題。也可采用溶劑抑制技術(shù)來解決溶劑信號(hào)對分析的阻礙問題,一般有3種途徑:(1不同頻道多重預(yù)飽和;(2激發(fā)脈沖序列照射;(3WET梯度場相位離散。預(yù)飽和常用于停止流動(dòng)模式中,而WET更適用于連續(xù)流動(dòng)模式。但多重溶劑抑制可能導(dǎo)致大量有用的NMR信息丟失,可采用部分氘代溶劑或同時(shí)使用兩種獨(dú)立的溶劑體系,由于兩者被抑制區(qū)域不同,綜合后即得到全面的1H光譜數(shù)據(jù)。2L C2NMR2MS在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用2.1在代謝物分析方面的應(yīng)用生物樣本中的藥物代謝物分析在新藥研究和臨床用藥監(jiān)控方面起著極為重要的作用。一般來說,用NMR進(jìn)行藥物代謝的研究有以下條件

14、:(1待測物分子中需含有具核磁矩的核素;(2這些核素在生物轉(zhuǎn)化過程中不易脫下;(3由于核磁共振儀靈敏度的限制,待測物給藥劑量應(yīng)較大;(4藥物給藥后的較短時(shí)間內(nèi)代謝,且代謝物的量滿足檢測限要求。1995年,Pullen等使用第一臺(tái)L C2NMR2MS系統(tǒng),嘗試性的從混合物中分離并鑒定一個(gè)有著兩個(gè)相連三唑環(huán)結(jié)構(gòu)的氟化物,取得了成功。后Connelly等人將2,32苯并呋喃(BF經(jīng)大鼠腹腔給藥后一定時(shí)間收集尿液,鑒別其代謝產(chǎn)物4。該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是先獲得MS數(shù)據(jù),再對NMR做指導(dǎo)性檢測,通過MS的快速分析獲得特定的分子質(zhì)量和離子碎片信息,其檢測對象為BF硫酸化的代謝產(chǎn)物,證明了不含核磁矩核素的化合物也可

15、以通過L C2NMR2MS系統(tǒng)鑒定其結(jié)構(gòu)。目前的文獻(xiàn)報(bào)道中,對對乙酰氨基酚體內(nèi)代謝物的研究工作較為系統(tǒng)和全面。1996年,Shockcor等對對乙酰氨基酚在人尿液中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測5,以乙腈2重水混合體系做反相梯度洗脫,經(jīng)UV檢測器后分流,ESI離子阱質(zhì)譜作陽離子檢測,另以一選擇性正弦脈沖裝置作溶劑抑制。結(jié)果表明,除預(yù)期的藥物代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)得以確定外,還檢測到了一些不易在人尿液中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性代謝物。之后,Burton 等用相似的液相分離條件對同樣的對乙酰氨基酚生物藥物樣本進(jìn)行分析6。選擇WET溶劑抑制技術(shù),在連續(xù)流動(dòng)模式下獲得1H NMR光譜數(shù)據(jù),并以單四極桿質(zhì)譜儀同時(shí)對正負(fù)離子進(jìn)行檢測。冷凍

16、探針技術(shù)出現(xiàn)后,Spraul等仍以對乙酰氨基酚的人尿液代謝產(chǎn)物為分析對象,與早前報(bào)道的普通探針檢測結(jié)果比較,使用冷凍探針的檢測靈敏度大幅升高7。L C2F T/IR(傅立葉紅外2TOF/MS(飛行時(shí)間質(zhì)譜2 NMR多重聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的出現(xiàn)將L C2NMR2MS帶入了一個(gè)新的階段。由于各檢測器對化合物響應(yīng)強(qiáng)度不同,檢測限也不同,通常需要對流動(dòng)相進(jìn)行多次分流來避免UV和MS的超載問題。這種聯(lián)用模式為樣品中主要成分和雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定提供大量信息,使分析更為快速準(zhǔn)確。Louden等人以非甾類化合物為例,對此新系統(tǒng)的適應(yīng)性做了考察8。L C2SPE2NMR2MS系統(tǒng)也是該領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù),可在冷凍探針的基礎(chǔ)上

17、,再次提高檢測靈敏度。G odejohann等人將該系統(tǒng)用于人尿液中對乙酰氨基酚的微量濃度代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定9,結(jié)果證明,當(dāng)待測物濃度很低、量很少時(shí),該系統(tǒng)是最有效的分析手段之一。通常認(rèn)為,加熱的重水是L C2NMR2MS系統(tǒng)最理想的流動(dòng)相,其優(yōu)勢在于:(1相對于其他氘代有機(jī)溶劑來說價(jià)格便宜;(2雜質(zhì)少,純度高;(3基線噪聲極小,且可以選擇性將目標(biāo)待測物中部分活潑質(zhì)子氘代,以獲得清晰的1H NMR 信號(hào)。Smith等人以水楊酰胺和一系列磺胺藥物為樣品作了深入研究,隨后又將此體系用于維生素類藥物的檢測10,均證明了這一點(diǎn)?；贚 C2NMR2MS聯(lián)用檢測系統(tǒng)的巨大優(yōu)越性和發(fā)展?jié)摿?科研者們在該領(lǐng)域

18、做了大量實(shí)驗(yàn)工作,已報(bào)道的化合物有:布洛芬(ibuprofen在人體尿液中的代謝產(chǎn)物,22氯242三氟苯甲銨、22溴242三氟苯甲銨和胡椒堿在大鼠尿液中的代謝產(chǎn)物11,HIV21逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的代謝產(chǎn)物12等等。此外,也有文獻(xiàn)報(bào)道將該技術(shù)用于糖苷類和氨基酸類化合物的檢測13。Sandvoss等對該系統(tǒng)近年來在藥物代謝物檢測方面的應(yīng)用作了較為詳盡的研究14。2.2在天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定方面的應(yīng)用絕大多數(shù)藥品和功能性食品的主要成分都是直接存在于自然界中的天然化合物,對天然產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的分析和鑒定提出了更高的要求。Wilson等將L C2NMR2MS用作蠅子草提取物中脫皮素的結(jié)構(gòu)鑒定,這是L C2NMR

19、2MS首次被應(yīng)用在天然產(chǎn)物方面15。實(shí)驗(yàn)以1H213C流動(dòng)液槽探針NMR與ESI離子阱質(zhì)譜并聯(lián),在連續(xù)流動(dòng)模式下獲得所有峰數(shù)據(jù),再針對目標(biāo)峰進(jìn)行停流模式檢測,并對流動(dòng)相采用WET溶劑抑制。G il 等在對啤酒、葡萄酒提取液中芳香化合物的檢測實(shí)驗(yàn)中16,使用1H213C反檢測流動(dòng)探針,順利實(shí)現(xiàn)了對樣品中芳香化合物的檢測。Wolfender等以古柯科植物為原料,對其中的托品類生物堿成分進(jìn)行了檢測;并且使用柱前衍生化技術(shù)與L C2NMR2MS系統(tǒng)聯(lián)用,鑒定了子菜科植物提取物中的多種極性化合物成分,成功分離出了其中的新成分17。大量實(shí)驗(yàn)證明,L C2NMR2MS聯(lián)用系統(tǒng)在多種天然產(chǎn)物成分的結(jié)構(gòu)鑒定方面

20、效果卓著。較之臨床樣品,天然產(chǎn)物的成分更加復(fù)雜,分離更加耗時(shí)耗力。L C2NMR2MS系統(tǒng)與SPE技術(shù)聯(lián)用,在目標(biāo)峰進(jìn)入NMR檢測之前對其進(jìn)行濃集,避免了繁復(fù)的樣品前處理問題。3展望綜上所述,在線L C2NMR2MS聯(lián)用系統(tǒng)是鑒定化合物結(jié)構(gòu)的一個(gè)有效手段,能夠解決許多單用L C2MS或L C2NMR 無法解決的問題,并且不需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的分離和提純。特別是近年來冷凍探針技術(shù)、微探針技術(shù)、流動(dòng)相抑制技術(shù)等先進(jìn)技術(shù)的發(fā)展,使得L C2NMR2MS檢測靈敏度大大增加,應(yīng)用領(lǐng)域也更加廣泛,尤其是在生物醫(yī)學(xué)和藥學(xué)方面,對生物樣本分析、藥物體內(nèi)代謝過程研究、天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定等等,取得了不錯(cuò)的進(jìn)展。由于

21、3種儀器聯(lián)用本身需要比較高的成本和一些技術(shù)條件的限制,目前國內(nèi)以其為手段的相關(guān)研究較少,研究工作者們還需要對相關(guān)的儀器和專業(yè)軟件進(jìn)行更深入的學(xué)習(xí)和應(yīng)用,讓這種先進(jìn)的技術(shù)更好的為我國醫(yī)藥事業(yè)服務(wù)。參考文獻(xiàn):1司伊康.核磁共振譜技術(shù)在藥物代謝研究中的應(yīng)用J.藥學(xué)學(xué)報(bào),1997,32(3:2362240.2安登魁.現(xiàn)代藥物分析選論M.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2001.2442498.3Sandvoss M,Bardsley B,Beck TL,et al.HPL C2SPE2NMR inpharmaceutical development:capabilities and applications

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