新風(fēng)膠囊對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠行為及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

1、新風(fēng)膠囊對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠行為及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響         【摘要】  觀察新風(fēng)膠囊（Xinfeng Capsule, XFC）對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis, AA）大鼠行為及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響。方法：將55只大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型組、甲氨喋呤（methotrexate, MTX）組，雷公藤多苷片（Tripterygium wilfordii glycosides tablet, TGT）組和新風(fēng)膠囊（Xinfeng Capsule, XFC）組。每組各11只。

2、除正常對(duì)照組外，向每只大鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑（Freunds complete adjuvant, FCA）0.1 ml制成AA模型。觀察各組大鼠行為和心肌超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：各治療組大鼠的足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著降低。其中XFC組大鼠的自主活動(dòng)次數(shù)顯著增加，跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，跳下平臺(tái)的時(shí)間（stepdown latency, SDL）延長，反應(yīng)時(shí)間（escape latency, EL）縮短；心肌肌原纖維整體結(jié)構(gòu)完整，大部分嵴突完整。XFC在改善AA大鼠行為及心肌組織超微結(jié)構(gòu)方面，優(yōu)于其余兩治療組。結(jié)論：AA大鼠可出現(xiàn)行為改變及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，XFC既可以全面改善

3、AA大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，同時(shí)也能改善其行為。 【關(guān)鍵詞】  新風(fēng)膠囊; 佐劑性關(guān)節(jié)炎; 行為; 心肌; 大鼠Objective: To observe the effects of Xinfeng Capsule (XFC), a compound Chinese herbal medicine, on behaviors and myocardial ultrastructure in adjuvant arthritis (AA) rats.Methods: Fiftyfive rats were randomly divided into normal control gro

4、up, untreated group, methotrexate (MTX) group, Tripterygium wilfordii glycosides tablet (TGT) group and XFC group. There were 11 rats in each group. Except for those in the normal control group, the rats in the other groups were all intracutaneously given 0.1 ml Freunds complete adjuvant in the righ

5、t hind limb. Changes of behaviors and myocardial ultrastructure of the rats in different groups were observed.Results: Voix pedis swelling and arthritis index in XFC, MTX and TPT groups were all obviously improved as compared with the untreated group. After XFC treatment, the autonomic activities we

6、re obviously increased, number of errors in exercise period and test period were obviously decreased, stepdown latency (SDL) was lengthened and escape latency (EL) was shortened. Overall structure of myocardial myofibril and the majority of cristae was intact in XFC group. The effects of XFC in impr

7、oving the behaviors and myocardial ultrastructure were better than those of MTX and TPT.Conclusion: Changes of behaviour and myocardial ultrastructure of AA rats can be observed. XFC can improve the myocardial ultrastructure of AA rats as well as their behaviors.Keywords: Xinfeng Capsule; adjuvant a

8、rthritis; behavior; myocardium; rats   類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為特征的自身免疫性疾病。病變呈持續(xù)反復(fù)發(fā)作過程。RA嚴(yán)重影響患者的軀體健康。大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis, AA)是研究RA的重要模型1，本研究采用AA大鼠動(dòng)物模型，觀察AA大鼠行為、心肌超微結(jié)構(gòu)（包括線粒體腫脹、空泡變、嵴突病變、肌漿網(wǎng)等）的變化及健脾化濕通絡(luò)中藥新風(fēng)膠囊對(duì)其的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性S

9、D大鼠55只，購于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字01號(hào)），平均體質(zhì)量（200±20）g，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型組、甲氨喋呤（methotrexate, MTX）組、雷公藤多苷片（Tripterygium wilfordii glycosides tablet, TGT）組和新風(fēng)膠囊（Xinfeng Capsule, XFC）組。每組各11只。1.2  藥品及試劑 XFC由安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，藥物主要由薏苡仁、黃芪、蜈蚣、雷公藤等組成。每粒膠囊含生藥浸出物0.5 g，院內(nèi)批號(hào)為20070129；MTX由上海醫(yī)藥有限

10、公司信誼制藥總廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)為070104，2.5 mg/片；TGT為上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)為061102，10 mg/片；弗氏完全佐劑 （Freunds complete adjuvant, FCA)為美國Sigma公司出品，生產(chǎn)批號(hào)為076K8905。1.3  主要儀器與設(shè)備 大鼠足容積測(cè)定儀（自制）、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥理研究所研制的大鼠跳臺(tái)儀（stepdown test）、大鼠自發(fā)活動(dòng)測(cè)試箱和日本電子公司生產(chǎn)的JEM1230型透射電子顯微鏡等。1.4  實(shí)驗(yàn)方法1.4.1  動(dòng)物處理 除正常對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物均右足跖皮

11、內(nèi)注射FCA 0.1 ml制成佐劑性關(guān)節(jié)炎AA模型2。致炎后第19天開始給藥。（1）XFC組：將XFC去除膠囊殼研成細(xì)末，加生理鹽水制成混懸液（每毫升含生藥浸出物0.3 g），按10 ml/kg的劑量灌胃，1次/d；（2）TGT組：將TGT研成細(xì)末，加生理鹽水制成混懸液（每毫升含雷公藤多苷1 mg），按10 ml/kg的劑量灌胃，1次/d；（3）MTX組：將MTX研成細(xì)末，加生理鹽水制成混懸液（每毫升含MTX 0.3 mg），按10 ml/kg的劑量灌胃，每周1次，未給藥的實(shí)驗(yàn)日，給予生理鹽水灌胃，10 ml/kg，1次/d；（4）正常組及模型組予生理鹽水灌胃，10 ml/kg，1次/d。各組

12、療程均為30 d。1.4.2  足跖腫脹度測(cè)算 分別在造模前1天、致炎后第18天及給藥后每3 d測(cè)量一次各組大鼠后足跖的容積，計(jì)算各組大鼠足跖腫脹度 3。腫脹度（%）=（VtVn）/Vn×100（Vn、Vt分別代表造模前后的容積）。1.4.3  關(guān)節(jié)炎指數(shù)的計(jì)算 致炎后第12天開始觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，每3 d觀察1次。全身病變按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)，根據(jù)未注射佐劑的其余3只肢體的病變程度累積積分，計(jì)算出關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index, AI）4。0分：無紅腫；1分：小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；

13、4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。把各個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來，即為每只大鼠的AI。1.4.4  大鼠行為學(xué)測(cè)定1.4.4.1  跳臺(tái)法測(cè)定  根據(jù)李儀奎5法略加改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)大小約45 cm×30 cm×50 cm的有機(jī)玻璃箱，用黑色塑料板分隔成2間，底面是銅柵，間距為0.8 cm，可以通電，電壓由一變壓器控制。每間左后角置一高5 cm、直徑8 cm的橡膠平臺(tái)，作為大鼠回避電擊的安全區(qū)。將動(dòng)物放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3 min，然后立即通36 V交流電。動(dòng)物受到電擊，正常反應(yīng)是跳上平臺(tái)以躲避傷害性刺激。多數(shù)動(dòng)物會(huì)再次或多次跳至銅柵，受到電擊后

14、又迅速跳回平臺(tái)。如此訓(xùn)練5 min，大鼠受到電擊的次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù)。訓(xùn)練時(shí)觀察記錄大鼠受到電刺激后跳上平臺(tái)的時(shí)間，以此作為反應(yīng)時(shí)間（escape latency, EL）。訓(xùn)練后24 h進(jìn)行測(cè)驗(yàn)，將大鼠放于平臺(tái)上，底部柵板同時(shí)通電，記錄大鼠跳下平臺(tái)的時(shí)間（stepdown latency, SDL），并記錄5 min內(nèi)跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)。1.4.4.2  自發(fā)活動(dòng)測(cè)試 實(shí)驗(yàn)在與計(jì)算機(jī)相連的專用圓形暗箱內(nèi)進(jìn)行，紅外探頭自動(dòng)記錄大鼠3 min內(nèi)活動(dòng)次數(shù)，每只大鼠測(cè)3次，取平均值。1.4.5  心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 參考文獻(xiàn)6觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。動(dòng)物處死后，剪下心臟，從

15、心尖向心底部切開，取左心室心尖部心肌組織各2塊，心肌每塊體積1 mm×1 mm×2 mm；將組織塊置于4.5%戊二醛中固定2 h，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗后，再用1%鋨酸后固定1 h，經(jīng)丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂Epon 812包埋，超薄切片機(jī)切片，片厚70 nm，先后經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，透射電子顯微鏡觀察。1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 11.0進(jìn)行單因素方差分析（OneWayANOVA），組間比較用t檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。       

16、  2  結(jié)  果2.1  各組大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度和AI的變化 致炎前各組大鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。致炎18 d給藥前，與正常對(duì)照組相比，模型組、MTX組和TGT組大鼠體質(zhì)量顯著下降（P0.01）；給藥30 d后，與模型組比較，正常對(duì)照組、TGT組和XFC組體質(zhì)量顯著升高（P0.01），且XFC組大鼠體質(zhì)量明顯高于MTX和TGT組（P0.05）。見表1。致炎18 d給藥前與正常對(duì)照組相比，模型組、TGT組、XFC組大鼠足跖腫脹度顯著升高（P0.01），MTX組跖腫脹度升高（P0.05）；給藥30 d后與模型組比較，正常對(duì)照組、MTX組和

17、XFC組足跖腫脹度顯著下降（P0.01），TGT組下降（P0.05）；與TGT組比較，正常組和MTX組足跖腫脹度顯著下降（P0.05）。見表1。致炎18 d給藥前與正常對(duì)照組相比，各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高（P0.01）；給藥30 d后與模型組相比，各組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著降低（P0.01），TGT組與MTX組和XFC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。見表2。表1  各組大鼠體質(zhì)量的變化（略）表2  各組大鼠足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化（略）2.2  各組大鼠行為的變化 與模型組相比，各組自主活動(dòng)明顯增加，跳臺(tái)訓(xùn)練期和測(cè)試期的錯(cuò)誤次數(shù)均明顯減少（

18、P0.01），SDL顯著延長而EL顯著縮短（P0.01）；XFC組SDL較MTX組顯著延長（P0.05）。見表3。表3  各組大鼠行為的變化（略）2.3  各組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變 正常對(duì)照組心肌細(xì)胞分界清晰，肌原纖維的明帶和暗帶分界清楚，肌絲結(jié)構(gòu)規(guī)則，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)完整，肌漿網(wǎng)無擴(kuò)張。模型組心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)空泡樣變，心肌纖維破壞，閏盤結(jié)構(gòu)不完整，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張。MTX組心肌細(xì)胞內(nèi)肌纖維紊亂，線粒體不清楚，有空泡樣變，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張。TGT組心肌細(xì)胞少數(shù)線粒體有嵴紊亂，肌漿網(wǎng)有擴(kuò)張、空泡樣變。XFC組肌原纖維整體結(jié)構(gòu)尚完整，大部分嵴突完整，個(gè)別

19、線粒體空泡樣變。見圖1。3  討  論   RA是一種常見的以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，因其病程較長、致殘率高，不僅影響患者的生理健康，還嚴(yán)重影響患者的心理健康。RA常伴有抑郁癥狀。Dickens等7研究發(fā)現(xiàn)，超過80%的RA患者有抑郁情緒，15%的RA患者有嚴(yán)重的抑郁癥。國內(nèi)亦有調(diào)查表明，136例RA患者焦慮情緒患病率為36.76%，抑郁情緒患病率為61.76%8。研究表明心理疾病可引起一系列免疫功能的改變，而免疫功能的改變也可引起人和動(dòng)物情緒與行為的改變9。   臨床研究表明，RA的中醫(yī)基本病機(jī)是氣血不足、脾

20、虛濕盛、痰瘀互結(jié)10。XFC具有益氣健脾、化濕通絡(luò)的功效。其中雷公藤具有免疫抑制作用，可抑制RA患者體內(nèi)異常免疫反應(yīng)；黃芪、薏苡仁與雷公藤相配一方面可以調(diào)節(jié)免疫，另一方面可以防止雷公藤免疫抑制作用大而造成機(jī)體免疫功能過于低下?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，黃芪富含黃酮、多糖、苷類和多種氨基酸，能增強(qiáng)免疫功能，調(diào)節(jié)糖代謝，加速受損組織修復(fù)，提高血清一氧化氮含量并抵抗心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)受損11。蜈蚣具有改善微循環(huán)、消除血栓、鎮(zhèn)靜止痛、抗炎和降壓等作用，可明顯改善心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)12。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明XFC能顯著改善AA大鼠的足跖腫脹，顯著降低AA大鼠的病變關(guān)節(jié)滑膜、胸腺、脾臟及胃黏膜細(xì)胞線粒體的病變率，對(duì)免疫

21、器官及消化道有保護(hù)作用；XFC對(duì)AA大鼠綜合療效的作用機(jī)制可能與保護(hù)免疫器官，調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫功能，改善微循環(huán)等有關(guān)13，14。   本實(shí)驗(yàn)研究表明，注射FCA后可引起AA大鼠行為學(xué)改變。XFC與MTX和TGT一樣能降低佐劑關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足跖腫脹度，說明其具有抑制炎癥作用。實(shí)驗(yàn)表明XFC能明顯延長大鼠跳臺(tái)錯(cuò)誤潛伏期，減少其錯(cuò)誤次數(shù)；明顯減少大鼠被電擊的次數(shù)，顯著縮短大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期，延長大鼠在平臺(tái)停留的時(shí)間。說明XFC對(duì)AA大鼠的行為有明顯改善作用。XFC組心肌肌原纖維及嵴突整體結(jié)構(gòu)完整，MTX和TGT組心肌細(xì)胞內(nèi)有線粒體嵴紊亂或斷裂，肌漿網(wǎng)有擴(kuò)張、空泡樣變。XFC在全面改

22、善AA大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的同時(shí)也可改善其行為?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Shao CS, Zhu SH. Clinical disease and immunity. Beijing: Peoples Medical Publishing House. 2002: 178179. Chinese.邵傳森, 朱圣禾. 臨床疾病與免疫. 北京: 人民衛(wèi)生出版社. 2002: 178179.2 Xu SY, Bian RL, Chen X. Pharmacology experiment methodology. 3rd ed. Beijing: Peoples Medical Publish

23、ing House. 2002: 919921. Chinese.徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué). 第3版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社. 2002: 919921. 3 Xu SY, Bian RL, Chen X. Pharmacology experiment methodology. 2nd ed. Beijing: Peoples Medical Publishing House. 1994: 719. Chinese. 徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué). 第2版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社. 1994: 719.4 Zhang JT, Experimental me

24、thods of modern pharmacology. Beijing: United Publishing House of Beijing Medical University and Peking Union Medical College. 1998: 1383. Chinese. 張鈞田. 現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法. 北京: 北京醫(yī)科大學(xué), 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社. 1998: 1383.5 Li YK. Traditional Chinese medicine pharmacology experiment methodology. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers. 1991: 172. Chinese. 李儀奎. 中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué). 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社. 1991: 172.6 Meng JZ, Peng KF, Geng M, et al