第4章 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)

1、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) （ProteinProtein）1838年，年，J. J. Berzelius提出，由提出，由proteios衍生而來衍生而來 第一重要，首要的物質(zhì)第一重要，首要的物質(zhì)l蛋白質(zhì)存在于蛋白質(zhì)存在于所有所有生物細(xì)胞中，是生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。能物質(zhì)。l蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，參蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與了幾乎所有的生命活動(dòng)過程。與了幾乎所有的生命活動(dòng)過程。一、蛋白質(zhì)通論一、蛋白質(zhì)通論、蛋白質(zhì)的含氮量、蛋白質(zhì)的含氮量v蛋白氮占生物組織所有含氮物質(zhì)的絕大部分。蛋白氮占生物組織所有含氮物質(zhì)的絕大部分。v大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量

2、接近于大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量接近于16%16% 蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量 = = 每克樣品中含氮的克數(shù)每克樣品中含氮的克數(shù) 6.256.25v凱氏定氮法凱氏定氮法、蛋白質(zhì)的分類、蛋白質(zhì)的分類（1 1）、依據(jù)外形分類）、依據(jù)外形分類 球狀蛋白質(zhì)：球狀蛋白質(zhì)：globular protein 纖維狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)：fibrous protein 膜蛋白質(zhì)膜蛋白質(zhì)：membrane protein （2 2）、依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類）、依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類 簡(jiǎn)單蛋白簡(jiǎn)單蛋白 simple protein 單純蛋白，僅由氨基酸組成單純蛋白，僅由氨基酸組成 結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 conjugated protei

3、n由簡(jiǎn)單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成由簡(jiǎn)單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單蛋蛋白白 清蛋白和球蛋白清蛋白和球蛋白 albumin and globulin 廣泛存在于動(dòng)物組織廣泛存在于動(dòng)物組織 谷蛋白和醇溶谷蛋白谷蛋白和醇溶谷蛋白 glutelin and prolamin 植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/ /堿堿 精蛋白和組蛋白精蛋白和組蛋白 堿性蛋白存在于細(xì)胞核堿性蛋白存在于細(xì)胞核 硬蛋白硬蛋白 結(jié)結(jié)合合蛋蛋白白 色蛋白：色蛋白：簡(jiǎn)單蛋白簡(jiǎn)單蛋白+ +色素物質(zhì)色素物質(zhì) 糖蛋白：糖蛋白：簡(jiǎn)單蛋白簡(jiǎn)單蛋白+ +糖類物質(zhì)糖類物質(zhì) 脂蛋白：脂蛋白：簡(jiǎn)單蛋白簡(jiǎn)單蛋白

4、+ +脂類結(jié)合脂類結(jié)合 核蛋白核蛋白：簡(jiǎn)單蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+ +核酸核酸（二）、蛋白質(zhì)的大小與分子量（二）、蛋白質(zhì)的大小與分子量 蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子 對(duì)任一種給定的蛋白質(zhì)，其所有分子在對(duì)任一種給定的蛋白質(zhì)，其所有分子在AAAA組成和順序以及肽鏈的長(zhǎng)度組成和順序以及肽鏈的長(zhǎng)度方面都應(yīng)方面都應(yīng)是相同的，即所謂均一的蛋白質(zhì)。是相同的，即所謂均一的蛋白質(zhì)。l蛋白質(zhì)與多肽無嚴(yán)格的界線蛋白質(zhì)與多肽無嚴(yán)格的界線 通常將通常將6000Dr6000Dr以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。l蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)月示月示胨胨多肽多肽

5、肽肽AAAA 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)層層次次一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象空間構(gòu)象示示例例（四）、蛋白質(zhì)功能的多樣性（四）、蛋白質(zhì)功能的多樣性 1. 1. 催化功能催化功能- -酶酶 2. 2. 調(diào)節(jié)功能調(diào)節(jié)功能- -激素、基因調(diào)控因子激素、基因調(diào)控因子 3. 3. 轉(zhuǎn)運(yùn)功能轉(zhuǎn)運(yùn)功能- -膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、血紅膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、血紅/ /血清蛋白血清蛋白 4. 4. 貯存功能貯存功能

6、- -乳、蛋、谷蛋白乳、蛋、谷蛋白 5. 5. 運(yùn)動(dòng)功能運(yùn)動(dòng)功能- -鞭毛、肌肉蛋白鞭毛、肌肉蛋白 6. 6. 結(jié)構(gòu)成分結(jié)構(gòu)成分- -皮、毛、骨、牙、細(xì)胞骨架皮、毛、骨、牙、細(xì)胞骨架 7. 7. 支架作用支架作用- -接頭蛋白接頭蛋白 8. 8. 防御功能防御功能- -免疫球蛋白免疫球蛋白 9. 9. 異常功能異常功能AA-NHAA-NH2 2與另一與另一AA-COOHAA-COOH間失水形成的酰胺鍵間失水形成的酰胺鍵稱肽鍵，所形成的化合物稱肽。稱肽鍵，所形成的化合物稱肽。l由兩個(gè)由兩個(gè)AAAA組成的肽稱為二肽。組成的肽稱為二肽。l由多個(gè)由多個(gè)AAAA組成的肽則稱為多肽。組成的肽則稱為多肽。l

7、組成多肽的組成多肽的AAAA單元稱為氨基酸殘基。單元稱為氨基酸殘基。CCNCCNCCNCCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽鍵 多肽鏈中多肽鏈中AAAA殘基按一定順序排列：氨基酸順序殘基按一定順序排列：氨基酸順序 含游離含游離 - -氨基的一端：氨基端或氨基的一端：氨基端或N-N-端端 含游離含游離 - -羧基的一端：羧基端或羧基的一端：羧基端或C-C-端端 AAAA順序是從順序是從N-N-端開始以端開始以C-C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)端氨基酸殘基為終點(diǎn) 如上述五肽：如上

8、述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSer-Val-Tyr-Asp-Gln（一）、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)（一）、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽鍵中肽鍵中C-NC-N鍵有部分鍵有部分 雙鍵性質(zhì)雙鍵性質(zhì) 不能自由旋轉(zhuǎn)不能自由旋轉(zhuǎn)組成肽鍵原子處于組成肽鍵原子處于 同一平面（肽平面）同一平面（肽平面）鍵長(zhǎng)及鍵角一定鍵長(zhǎng)及鍵角一定大多數(shù)情況以反式大多數(shù)情況以反式 結(jié)構(gòu)存在結(jié)構(gòu)存在共價(jià)主鏈共價(jià)主鏈 肽末端肽末端-羧基羧基pKa值比游離值比游離AA中的大。中的大。 肽末端肽末端-氨基氨基pKa值比游離值比游離AA中的小。中的小。 等電點(diǎn)（兩性）。等電點(diǎn)（兩性）。 酸堿性質(zhì)取決于：酸堿性質(zhì)取決于： -羧基、羧基、-氨基、

9、側(cè)鏈基團(tuán)的解離氨基、側(cè)鏈基團(tuán)的解離 具有雙縮脲反應(yīng)具有雙縮脲反應(yīng)Pr特有的反應(yīng)。特有的反應(yīng)。（三）、（三）、 天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽NHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH鵝膏覃堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)CysTyrILeGlnAsnCysProLeuGlyNH2SS牛催產(chǎn)素CysTyrGlnAsnCysProSSPheArgGlyNH2牛加壓素三、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定三、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定什么是什么是PrPr的一級(jí)結(jié)構(gòu)？的一級(jí)結(jié)構(gòu)？蛋白質(zhì)中氨基酸的排列

10、順序。 1.1.樣品必需純（樣品必需純（97%97%以上）以上） 2.2.知道蛋白質(zhì)的分子量知道蛋白質(zhì)的分子量 3.3.知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成 4.4.測(cè)定蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)的AAAA組成并根據(jù)分子量組成并根據(jù)分子量 計(jì)算每種計(jì)算每種AAAA的個(gè)數(shù)的個(gè)數(shù) 5.5.測(cè)定水解液中的氨量計(jì)算酰胺的含量測(cè)定水解液中的氨量計(jì)算酰胺的含量前提前提（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(1) 測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 通過測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋通過測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可

11、確定多肽鏈的數(shù)目。鏈的數(shù)目。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(2)(2) 多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略 幾條多肽鏈借助幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵非共價(jià)鍵連接在一起，連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，血紅蛋白為四聚體，稱為寡聚蛋白質(zhì)，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體。烯醇化酶為二聚體。 可用可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L鹽酸胍處理，鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈即可分開多肽鏈( (亞基亞基) )。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(3)(3) 斷開二硫鍵斷開二硫鍵 在在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol

12、/L6mol/L鹽酸胍存在下，鹽酸胍存在下，用過量的用過量的 - -巰基乙醇巰基乙醇處理，使二硫鍵還處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)烷基化試劑保護(hù)生成生成的巰基，防止重新被氧化。的巰基，防止重新被氧化。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(4)(4)測(cè)定每條多肽鏈的測(cè)定每條多肽鏈的AAAA組成，并計(jì)算組成，并計(jì)算出出AAAA成分的分子比成分的分子比 （一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(5)(5)分析多肽鏈的分析多肽鏈的N-N-末端和末端和C-C-末端末端(6)(6)多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段 采用兩采用兩/ /多種多種不同的斷裂方法

13、不同的斷裂方法將多肽將多肽 斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(7)(7)測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序(8)(8)確定肽段在多肽鏈中的次序確定肽段在多肽鏈中的次序 利用兩利用兩/ /多套肽段的多套肽段的AAAA順序彼此間的順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的AAAA順序。順序。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(9)(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。 兩類多肽鏈末端氨基酸殘基：兩類多肽鏈末端氨基酸殘基： N-N-端氨基酸端氨基酸

14、 C-C-端氨基酸端氨基酸 在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸殘基測(cè)定（二）、末端氨基酸殘基測(cè)定 Sanger法法 二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法O2NFNO2+ H2N CH CROHN CH CROO2NNO2H+H2OO2NNO2HN CH CROOH+氨基酸氨基酸DNFBN-端氨基酸端氨基酸DNP衍生物衍生物DNP-氨基酸氨基酸（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定N堿性條件堿性條件二硝基苯衍生物二硝基苯衍生物黃色黃色 二甲氨基萘磺酰二甲氨基萘磺酰-AA-AA

15、有強(qiáng)熒光，檢測(cè)靈敏度高有強(qiáng)熒光，檢測(cè)靈敏度高 丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）法）法N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定1N(DNS-aa)苯異硫氰酸酯（苯異硫氰酸酯（PITC)PITC)法法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定1NN=C=S + NCHCOOHHHRPITCNCNCHCOOHHHRSPTC-氨基酸NCHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF苯異硫氰酸酯苯異硫

16、氰酸酯PITC 肽鏈外切酶肽鏈外切酶: :從多肽鏈從多肽鏈N-N-端逐個(gè)向里水解端逐個(gè)向里水解 根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間測(cè)出釋放的根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間測(cè)出釋放的AAAA種類和數(shù)量，種類和數(shù)量， 按反應(yīng)時(shí)間和按反應(yīng)時(shí)間和AAAA殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)N-N-末端殘基順序。末端殘基順序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 水解以水解以LeuLeu殘基為殘基為N-N-末端的肽鍵速度最大。末端的肽鍵速度最大。氨肽酶法氨肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定1N 肼化物可與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)肼化物可與苯甲醛縮合成不溶于水的物

17、質(zhì) 肼解法肼解法H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定2C（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定2C C末端末端AA AA 氨基醇氨基醇 還原法還原法硼氫化鋰硼氫化鋰 肽鏈外切酶肽鏈外切酶: :從多肽鏈從多肽鏈C-C-端逐個(gè)水解端逐個(gè)水解 根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間釋放出的根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間釋放出的AAAA種類和數(shù)量種類和數(shù)量 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)C-C-末端殘基順序。末端殘基順序。 四種羧肽酶：四種羧肽酶：A

18、,B,CA,B,C和和Y Y； A A和和B(B(胰臟胰臟) )、C(C(柑桔葉柑桔葉) )、Y(Y(面包酵母面包酵母) ) A:A:除除Pro/Arg/Lys/Pro/Arg/Lys/外所有外所有C-C-末端末端AAAA殘基殘基 B: B:只水解只水解ArgArg和和LysLys為為C-C-末端殘基的肽鍵末端殘基的肽鍵 羧肽酶法羧肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定2C（三）、二硫鍵的斷裂（三）、二硫鍵的斷裂 鹽酸胍鹽酸胍/ /尿素解離多肽鏈間的非共價(jià)力。尿素解離多肽鏈間的非共價(jià)力。 應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫

19、鍵。鏈間的二硫鍵。1 1、酸水解、酸水解（四）、氨基酸組成的分析（四）、氨基酸組成的分析2 2、堿水解、堿水解1 1、酶解法酶解法: : 內(nèi)切酶：內(nèi)切酶：胰蛋白酶胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解多肽鏈的選擇性降解 （五）、多肽鏈的部分裂解和（五）、多肽鏈的部分裂解和 肽段混合物的分離純化肽段混合物的分離純化 R1=Lys（K）和）和Arg（R） 專一性較強(qiáng)，水解速度快專一性較強(qiáng)，水解速度快 R2=Pro（抑制）（抑制）NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH

20、 COR1肽鏈肽鏈水解位點(diǎn)水解位點(diǎn)胰蛋白酶胰蛋白酶trypsin R1=Phe（F）、）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性）等疏水性AA Leu、Met和和His稍慢稍慢 R2=Pro（抑制）（抑制） pH8-9NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1肽鏈肽鏈水解位點(diǎn)水解位點(diǎn)糜蛋白酶糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰水解速度與相鄰AAAA性質(zhì)有關(guān)性質(zhì)有關(guān): : 酸性：酸性：-/-/堿性：堿性：+ + R2=Phe（F）、）、 Trp（W）、）、 Tyr（Y）、）、Leu（L）、）、Ile（I）、）、Met（M

21、）、）、Val（V）及其它）及其它疏水性強(qiáng)的疏水性強(qiáng)的AA水解速度較快水解速度較快NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈肽鏈水解位點(diǎn)水解位點(diǎn)R2= Pro或或Gly，不水解，不水解R1或或R3=Pro，抑制水解，抑制水解嗜熱菌蛋白酶嗜熱菌蛋白酶（thermolysin) R1和和/或或R2Phe（F）、）、Trp（W）、）、Tyr（Y）、）、 Leu（L）及其它疏水性）及其它疏水性AA水解速度較快水解速度較快 R1=Pro（抑制）（抑制） pH2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈肽鏈水解位點(diǎn)水解位點(diǎn)胃蛋白酶胃蛋白酶PepsinNH

22、CHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈肽鏈水解位點(diǎn)水解位點(diǎn)羧肽酶和氨肽酶羧肽酶和氨肽酶2 2、化學(xué)裂解法、化學(xué)裂解法 溴化氰水解法溴化氰水解法(Cyanogen bromide)選擇性地切割由選擇性地切割由MetMet羧基形成的肽鍵。羧基形成的肽鍵。CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高絲氨酸內(nèi)酯（五）、多肽鏈的部分裂解和（五）、多肽鏈的部分裂解和 肽段混合物的分離純化肽段混合物的分

23、離純化多肽鏈的選擇性降解多肽鏈的選擇性降解 NH2OH斷裂：斷裂： 較專一性斷裂較專一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵之間的肽鍵 Asn-Leu及及Asn-Ala鍵也能部分?jǐn)嗔焰I也能部分?jǐn)嗔?3 3、肽段的分離純化：、肽段的分離純化： 凝膠過濾、凝膠電泳和凝膠過濾、凝膠電泳和HPLCHPLC法法N-N-端分析法端分析法特點(diǎn)：能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈特點(diǎn)：能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-N-端端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。1 1、 （六）、肽段氨基酸序列的測(cè)定（六）、肽段氨基酸序列的測(cè)定Edman于于1950年首先提出。年首先提出。PITCPTC-肽肽2 2、氨肽酶法或

24、羧肽酶法、氨肽酶法或羧肽酶法3 3、質(zhì)譜法（、質(zhì)譜法（MSMS） 靈敏度高、所需樣品少、測(cè)定速度快靈敏度高、所需樣品少、測(cè)定速度快核糖體核糖體蛋白質(zhì)鏈蛋白質(zhì)鏈4.4.根據(jù)核苷酸序列的推定法根據(jù)核苷酸序列的推定法（七）、肽段在多肽鏈中次序的決定重疊肽（重疊肽（overlaping peptide） 胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈 經(jīng)電泳分離各肽段經(jīng)電泳分離各肽段 用過甲酸斷開二硫鍵，含有用過甲酸斷開二硫鍵，含有-S-S-的肽段帶電性的肽段帶電性質(zhì)發(fā)生變化，轉(zhuǎn)向質(zhì)發(fā)生變化，轉(zhuǎn)向90二次電泳，曾含二硫鍵二次電泳，曾含二硫鍵的肽段遷移率發(fā)生變化的肽段遷移率發(fā)生變化 然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置硫鍵的位置（八）、二硫鍵位置的確定