凋亡調(diào)節(jié)因子與藥物耐受性

1、凋亡調(diào)節(jié)因子與藥物耐受性腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性是臨床化療失敗的重要原因。本文綜述細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子p53、bcl-2、bax等對腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制的影響和p53蛋白等對P一糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，并介紹部分多耐藥性新的研究進(jìn)展。放療和化療對腫瘤細(xì)胞有明顯殺傷作用。然而成功治療的一個重要障礙是腫瘤細(xì)胞對上述治療無反應(yīng)，并出現(xiàn)耐受細(xì)胞群，導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)或浸潤進(jìn)展。因此了解細(xì)胞對化療藥物耐受基礎(chǔ)成為許多實驗研究的熱點。一般而言，研究的重點是解釋治療因子怎樣達(dá)到細(xì)胞內(nèi)靶位點，并檢查藥物與靶位點相互作用的分子基礎(chǔ)，如高水平表達(dá)MDRI基因能夠限制多種藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，并引起多耐藥性（

2、MDR）。最近幾年里，探索和了解細(xì)胞凋亡機(jī)制，對腫瘤細(xì)胞獲得或失去耐受細(xì)胞毒性機(jī)制有了新的認(rèn)識。1 凋亡調(diào)節(jié)因子對耐藥性的調(diào)節(jié)作用許多藥物能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括抗代謝藥、脫氧核苷酸合成抑制劑、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、烷化劑及干擾微管藥物等1。化療藥物引起凋亡的過程還不十分清楚，可能是藥物打斷了正常的細(xì)胞生長周期所致2。凋亡是一種可以被激活或抑制的可調(diào)節(jié)過程，因此可能還有在某些情況下藥物耐受性的新解釋。1.1 p53野生型p53（wt-p53）在細(xì)胞生長過程中以“分子警察”身份監(jiān)視細(xì)胞內(nèi)DNA狀態(tài)，當(dāng)DNA受損后，p53通過轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定機(jī)制抑制細(xì)胞停留在G1期，使細(xì)胞有時間修復(fù)，若修復(fù)失敗，wt-p

3、53將角發(fā)細(xì)胞凋亡。wt-p53缺乏或發(fā)生突變，將失去“分子警察”作用，不能誘導(dǎo)受損細(xì)胞凋亡，而使受損細(xì)胞得以生存。但由于細(xì)胞失G1期細(xì)胞周期檢查點的DNA損傷監(jiān)視作用，易造成諸如缺失、擴(kuò)增和易位等染色體畸變。Malcomson3采用溫控p53表達(dá)載體轉(zhuǎn)染鼠胚胎成纖維細(xì)胞株，在鬼臼乙叉甙（VP-16）作用下，32條件時，wt-p53表達(dá)，細(xì)胞滯留在G1期，明顯表現(xiàn)出對藥物介導(dǎo)凋亡的耐受性；而在37時，表達(dá)突變型p53，細(xì)胞在VP-16作用下，無明顯生長抑制，繼續(xù)增殖，并顯示出劑量依賴性的細(xì)胞凋亡增多。提示wt-p53能介導(dǎo)細(xì)胞對VP-16的耐受性。wt-p53介導(dǎo)的耐藥性可能與藥物作用特點有關(guān)

4、。VP-16為細(xì)胞周期特異性藥，主要作用于細(xì)胞周期的S期，干擾DNA的合成。一定劑量的VP-16作用細(xì)胞后，wt-p53使得細(xì)胞滯留在G1期而不繼續(xù)增殖，因此，VP-16作用的靶位點減少，如同Topo酶含量下降介導(dǎo)的耐藥性一樣，引起細(xì)胞對VP-16的耐藥性。Wosikowski4檢測13例對阿霉素（ADM）、長春花堿、順鉑（CDDP）、VP-16和胺苯丫啶等耐藥的乳腺癌細(xì)胞株，僅1例發(fā)生p53基因突變。但許多學(xué)者認(rèn)為低濃度化療藥物可引起表達(dá)wt-p53的細(xì)胞凋亡，在缺乏wt-婦生基因突變后，須大劑量藥物方能引起細(xì)胞死亡5、wt-p53的缺失或突變間接導(dǎo)致了藥物耐受性。Lowe6通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)

5、，表達(dá)Wt-p53基因的腫瘤細(xì)胞在經(jīng)放射性和ADM治療后，絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡；相反，相同因子治療p53基因缺陷的腫瘤細(xì)胞MEFS，對放療和幾種化療藥物有較強(qiáng)的耐藥性。但將wt-p53基因轉(zhuǎn)染到MEFS細(xì)胞，低劑量放療，或小劑量的ADM、VP-16等藥物處理后細(xì)胞迅速凋亡。另有報道wt-p53能促進(jìn)體外培養(yǎng)的人粘液表皮樣癌細(xì)胞凋亡。p53對細(xì)胞耐藥性的調(diào)節(jié)可能是雙向的，具體作用方式可能與細(xì)胞種類、狀態(tài)及藥物作用特點和劑量有關(guān)。如突變型p53可能更多引起細(xì)胞對細(xì)胞周期非特異性藥物耐受，而wt-p53介導(dǎo)細(xì)胞對某些細(xì)胞周期異性藥物耐受。1.2 Bcl-2家族一些研究發(fā)現(xiàn)bcl-2基因家族蛋白表達(dá)水

6、平變化，能顯著改變腫瘤細(xì)胞株對化療藥物誘導(dǎo)凋亡的阻抗。Dole7用bcl-2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Shep-1，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)bcl-2克隆的細(xì)胞株對CDDP和VP-16引起的細(xì)胞毒性呈劑量依賴性阻抗。Miyashita1采用基因轉(zhuǎn)染方法，發(fā)現(xiàn)bcl-2能使細(xì)胞增加對地塞米松、氨甲喋呤、阿糖胞苷、長春新堿（VCR）、VP-16和CDDP等藥物耐受性。與對照組細(xì)胞相比， bcl-2蛋白并不影響藥物對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，但在維持細(xì)胞存活中起著重要調(diào)節(jié)作用。在VP-16和CDDP等化療藥物去除后，bcl-2蛋白能夠重新啟動細(xì)胞增殖，使細(xì)胞獲得耐藥性。Pantazis8研究VCR誘導(dǎo)人白血

7、病細(xì)胞株U-937/WT形成VCR耐藥細(xì)胞亞株U-937/RV，在U-937/WT細(xì)胞中不能檢出凋亡抑制蛋白bcl-2和bcl-xl表達(dá)，而在U-9377/RV均可檢出；但在U-937/RV中亦可檢出bax蛋白表達(dá)，后者是一種凋亡啟動因子，是一種bcl-2蛋白的異源二聚體，可抵銷bcl-2的活性作用，而在敏感株中未檢出bax蛋白。由此可見bcl-2家族在細(xì)胞耐藥過程中的作用也是相互調(diào)節(jié)和相互制約的。1.3 p53與bcl-2家庭間的相互影響細(xì)胞凋亡是一個多因子參加的復(fù)雜的生理過程，藥物影響能誘發(fā)p53和bcl-2等蛋白發(fā)生一系列變化，參與細(xì)胞的耐藥性。Miyashi9研究發(fā)現(xiàn)wt-p53能與b

8、cl-2基因上p53依賴性的負(fù)反應(yīng)元件結(jié)合抑制bcl-2的表達(dá)。Eliopoulos10檢測p53和bcl-2蛋白在敏感和耐藥的卵巢癌細(xì)胞株中表達(dá)水平，結(jié)果顯示耐藥株過度表達(dá)p53和bcl-2蛋白，且bcl-2作用環(huán)節(jié)可能在p53之上。許多臨床資料亦發(fā)現(xiàn)突變型p53和bcl-2蛋白的高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)。Ju11將wt-p53傳染wt-p53陰性的HL-60細(xì)胞形成轉(zhuǎn)染株SN3，與母代細(xì)胞相比，對化療藥物的敏感性明顯增加，如對CDDP和胸苷（thymidine）的敏感性分別增加2倍和50倍；而用突變型p53傳染的細(xì)胞無比現(xiàn)象。用胸苷合成酶抑制劑FdUrd觀察與p53相關(guān)聯(lián)基因表達(dá)變化，在各種濃

9、度的FdUrd存在下，很大比例的SN3細(xì)胞發(fā)生凋亡，而不是停留在S期。母代細(xì)胞有不確定的bax水平和高水平的bcl-2表達(dá)。在SN3細(xì)胞bcl-2檢測不出，并維持適當(dāng)基礎(chǔ)水平的bax。FdUrd治療后，wt-p53和bax水平增加，但bax誘導(dǎo)早于p53，且平行出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的DNA條帶。Perego12檢測p53與順鉑導(dǎo)致耐藥性間的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌藥細(xì)胞株中，突變型p53失去激活bax基因轉(zhuǎn)錄能力。這些資料說明p53、bax-2和bax等凋亡調(diào)節(jié)因子在腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制中起重要作用，但作用方式是復(fù)雜多樣的。2 p53對耐藥蛋白的調(diào)節(jié)作用p53具有不同結(jié)構(gòu)區(qū)域。wt-p53與DNA共有區(qū)結(jié)合

10、后，能正向調(diào)節(jié)一系列下游基因的表達(dá)。另外，wt-?負(fù)向調(diào)節(jié)許多缺乏wt-p53共有區(qū)結(jié)合位點基因，包括DNA topo、MDRI、c-fos和其它病毒和細(xì)胞的啟動子。2.1 p53對多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）表達(dá)的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子spl是MRP基因啟動子的強(qiáng)激動劑，wt-?與spl結(jié)合，消除spl作用，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)MRP表達(dá)。Wang13將帶有蟲熒光素酶標(biāo)記報告基因的MRP啟動子與wt-p53共同轉(zhuǎn)染p53陰性的人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299和鼠（10）1細(xì)胞，結(jié)果顯示wt-p53能呈劑量依賴性地顯著抑制MRP啟動子活性，wt-忍氣吞聲作用位點為-91到 103bp，該處有數(shù)個spl結(jié)合位點；

11、而突為型p53只有很弱的作用。同時研究還發(fā)現(xiàn)wt-p53還能抑制高表達(dá)MRP的CEM/VM-1-5細(xì)胞的內(nèi)源性MRP表達(dá)。Oshika14采用免疫組化技術(shù)檢測107例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本，MRP和突變型p53表達(dá)有明顯相關(guān)性，雙染色技術(shù)顯示p53和MRP在一些細(xì)胞上同時表達(dá)，這些病人預(yù)后明顯羅無MRP和突變型p53患者差。2.2 p53CF p-糖蛋白（P-gp）表達(dá)的調(diào)節(jié)P-gp是有MDR1基因編碼的多藥耐藥蛋白。wt-作用于MDR1下游啟動子，從轉(zhuǎn)錄水平P-gp的表達(dá)。Straussp15將wt-p53與由MDR1下游啟動子控制的報告分子共同轉(zhuǎn)染BHK和Sacs-2細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)wt-p53呈劑

12、量依賴性MDR1基因啟動子活性。Strauss16在另一 研究中發(fā)現(xiàn)部分p53的突變體能激活MDR2基因下游啟動子轉(zhuǎn)錄活恪，他將這種p53突變稱為“獲得功能性突變”。Linn17采用雙重免疫組化染色，核p53聚集和P-gp表達(dá)經(jīng)常發(fā)生在同一腫瘤細(xì)胞，且這種情況在浸潤進(jìn)展期的乳腺癌中更易見到。其推測共同表達(dá)突變型p53和P-gp屬于一系列分子事件，能導(dǎo)致腫瘤浸潤、藥物耐受，產(chǎn)生不良預(yù)后。3 其它凋亡調(diào)節(jié)因子對耐藥蛋白的調(diào)節(jié)作用Bcl-2與P-gp作用尚不明確，但Eid20采用免疫組化分析70例人睪丸腫瘤Bcl-2和P-gp表達(dá)，Bcl0-2和P-gp存在明顯的相關(guān)性（P=0.004）。C-myc

13、癌基因為一種參與細(xì)胞分化和惡性增殖的核蛋白型癌基因，具有促使DNA復(fù)制的功能，可在一些致癌因素作用下（如病毒、放射性和化學(xué)誘變劑）發(fā)生基因重排和擴(kuò)增而得以活化。C-myc基因表達(dá)既可促進(jìn)細(xì)胞增殖又可促使細(xì)胞凋亡，這種相互對立的作用受生長因子等調(diào)控。C-myc與P-gp的關(guān)系還不清楚，但有報告采用Southern印記雜交分析，發(fā)現(xiàn)同一惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生C-myc基因重排及MDR1基因限制性片段擴(kuò)增現(xiàn)象，推測C-myc基因活性MDR1基因的變化和腦膠質(zhì)瘤耐藥株的耐藥性可能存在較為密切的關(guān)系。但另一作者采用免疫組化方法研究67例胃癌標(biāo)本中p53、C-myc和P-gp的表達(dá)，P53的異常表達(dá)與P-g

14、p表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r-0.63,P0.05）,C-myc和P-gp的表達(dá)無明顯相關(guān)。N-myc也編碼一個調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的核酸化蛋白。N-myc基因的擴(kuò)增與MRP表達(dá)增加有關(guān)。Bordow19采用Rt-PCR觀察25例神經(jīng)母細(xì)胞瘤標(biāo)本，N-myc基因擴(kuò)增的標(biāo)本，MRP基因表達(dá)水平亦明顯增高（P=0.0016），而MDR1基因表達(dá)與N-myc癌基因擴(kuò)增無明顯關(guān)系。采用N-myc癌基因抑制劑RA研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SYSY和BE（2）-C，RA抑制N-myc基因表達(dá)后，MRP表達(dá)隨之下降（P-=0.0017），而MDR1基因表達(dá)量卻增加（P0.05）。Norris20分析60例原發(fā)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤

15、標(biāo)本，亦發(fā)現(xiàn)在N-myc擴(kuò)增的腫瘤，MRP表達(dá)水平明顯增（P0.001）。Kopnin2分析人ras基因?qū)DR1mRNA和P-gp表達(dá)影響。ras基因除能激活外源性MDR1基因啟動子外，還能引起內(nèi)源性MDR1mRNA水平升高，P-gp活性增加并使Rhodamine123外排增多，細(xì)胞對秋水仙素和其它一些化療藥物的耐藥性亦增加。Chin22研究發(fā)現(xiàn)人MDR1基因啟動子也是ras癌基因的靶位點，雖然其產(chǎn)物對MDR1基因的正向調(diào)節(jié)是非特異的，但與突變型p53有協(xié)同作用，而wt-p53無此作用。4 多藥耐藥性研究進(jìn)展最近研究資料發(fā)現(xiàn)耐藥蛋白的表達(dá)與其啟動子甲基化狀態(tài)有關(guān)。Nakayama23采用定量

16、Rt-PCR檢測42例急性白血病標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)MDR1基因啟動子上CpG位點甲基化狀態(tài)與MDR1基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。推測MDR1基因表達(dá)的必須條件。Kantharids24在T細(xì)胞白血病細(xì)胞株，采用甲基化敏感和甲基化不敏感的限制酶進(jìn)行Southern雜交分析，MDR現(xiàn)象與MDR1基因5端去甲基化明顯相關(guān)。采用去甲基化因子5一氮脫氧嘧啶治療P-gp表達(dá)陰性和陽性細(xì)胞株消除MDR1mRNA表達(dá)，可增加細(xì)胞對表柔比星（daunomycin）的耐受性。另外一些研究發(fā)現(xiàn)非細(xì)胞毒性劑量的一些基因毒性藥物，特別是DNA交聯(lián)因子，優(yōu)先改變可誘導(dǎo)的基因表達(dá)，這些作用主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平并引起暫時時性的DNA損傷。Ihu

17、at25發(fā)現(xiàn)DNA烷化劑絲裂霉素C能明顯MDR1mRNA及P-gp表達(dá)，并減少藥物外輸，對ADM耐受性減少到5到10倍。亞細(xì)胞毒性的CDDP也有此功能。在單層和球形培養(yǎng)的人和嚙齒動物的結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和肝癌細(xì)胞株都觀察到此現(xiàn)象。Kimsh26研究發(fā)現(xiàn)MDR1基因啟動子含有熱休克應(yīng)答元件，能與熱休克反應(yīng)元件結(jié)合，采用榭皮素（quereetin）抑制熱休克應(yīng)答元件與應(yīng)答因子間的結(jié)合，能逆轉(zhuǎn)MDR1介導(dǎo)的耐藥性。由于細(xì)胞凋亡的相關(guān)調(diào)節(jié)因子介入多藥耐藥機(jī)制，使得腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐受機(jī)制更加錯綜復(fù)雜。因此，在腫瘤細(xì)胞耐藥性研究中，應(yīng)從多角度、全方位考慮，才能制定出羅好的治療方案。另

18、外，對凋亡調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)耐藥機(jī)制的研究，可通過加強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑克服耐藥性。為惡性腫瘤的基因治療提供一些實驗依據(jù)。參 考 文 獻(xiàn)1 Miyashita T and Reed J Bolld,1993;81:1511572 Huschtscha L,Bartier WA,Eoss CE,et al.Br J cancer,1996;73:54603 Malcomson RDG,Oren M,Wyllie AH,et al.Br J cancer,1995;72:9529574 Wosikowski K,Regis TJ,Robey RW,et al.Cell Growth differ,199

19、5;6:139514035 Lowe SW,Ruley HE,Jacks T,et al.Cell,1993;74:9579676 Lowe SW,Bobis S,McClatchey A,et al.Science,1994;266:8078107 Dole M,Nunez G,Merchant AK,et al.Cancer Res,1994;54:325332598 Pantazis P,Chatterjee D,Han Z,et al.Eur J haematol,1996;57:79869 Miyashita J,Harigal M,Hanada M,et al.Cancer res

20、,1994;54:3131313510 Eliopoulos AG,Kerr DJ,Herod J,et al.Oncogene,1995;11:1217122111 Ju JF,Banerjee D,Lenz HJ,et al.Clin Cancer res,1998;4:1315132212 Perego P,Ciarola M,Righetti SC,et al.Cancer res,1996;56:55656213 Wang QJ and Beck.Cancer Res,1998;58:5762576914 Oshika Y,Nakamura M,Tokunaga T,et al.Mod pathol,1998;11:1059106315 Strauss BE,Shivakumar C,Deb SP,et al.Biochem Biophys res Commun,1995;217 :82583116 Strauss BE and Haas M