凍干優(yōu)化方案

1、凍干優(yōu)化方案徐秀20140123一.背景介紹1凍干發(fā)展背景由于凍干藥品呈多孔狀、能長時(shí)間穩(wěn)定貯存、并易重新復(fù)水而恢復(fù)活性,因此冷凍干燥技術(shù)廣泛應(yīng)用于制備固體蛋白質(zhì)藥物、口服速溶藥物及藥物包埋劑脂質(zhì)體等藥品。從國家藥品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)庫得知,目前國內(nèi)已有注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素2b、凍干鼠表皮生長因子、外用凍干重組人表皮生長因子、注射用重組鏈激酶、注射用重組人白介素-2、注射用重組人生長激素、注射用A群鏈球菌、注射用重組人干擾素2b、凍干人凝血因子V、凍干人纖維蛋白原、間苯三酚口服凍干片等凍干藥品獲準(zhǔn)上市。截止2000年2月,美國FDA已批準(zhǔn)的生物技術(shù)藥共計(jì)76個(gè)

2、。冷凍干燥技術(shù)最早于1813年由英國人Wollaston發(fā)明。1909年Shsckell試驗(yàn)用該方法對(duì)抗毒素、菌種、狂犬病毒及其它生物制品進(jìn)行凍干保存,取得了較好效果。在第二次世界大戰(zhàn)中,對(duì)血液制品的大量需求大大刺激了冷凍干燥技術(shù)的發(fā)展,從此該技術(shù)進(jìn)入了工業(yè)應(yīng)用階段。此后,制冷和真空設(shè)備的飛速發(fā)展為快速發(fā)展冷凍干燥技術(shù)提供了強(qiáng)有力的物質(zhì)條件。進(jìn)入上個(gè)世紀(jì)后,科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展和人民群眾對(duì)健康保障的需求為藥品冷凍干燥技術(shù)的飛速發(fā)展提供了強(qiáng)大的動(dòng)力,在藥品凍干損傷和保護(hù)機(jī)理、藥品凍干工藝、藥品冷凍干燥機(jī)等方面取得了巨大的成績。但藥品冷凍干燥技術(shù)是一門邊緣學(xué)科,需要生物學(xué)、藥學(xué)、制冷、真空和控制等知

3、識(shí)的交叉和綜合,因此仍存在亟待解決的問題。2藥品冷凍干燥原理及特點(diǎn)藥品冷凍干燥是指把藥品溶液在低溫下凍結(jié),然后在真空條件下升華干燥,除去冰晶,待升華結(jié)束后再進(jìn)行解吸干燥,除去部分結(jié)合水的干燥方法。該過程主要可分為:藥品準(zhǔn)備、預(yù)凍、一次干燥(升華干燥和二次干燥(解吸干燥、密封保存等五個(gè)步驟。藥品按上述方法凍干后,可在室溫下避光長期貯存,需要使用時(shí),加蒸餾水或生理鹽水制成懸浮液,即可恢復(fù)到凍干前的狀態(tài)。與其它干燥方法相比,藥品冷凍干燥法具有非常突出的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn):a 藥液在凍結(jié)前分裝,劑量準(zhǔn)確;b 在低溫下干燥,能使被干燥藥品中的熱敏物質(zhì)保留下來;c 在低壓下干燥,被干燥藥品不易氧化變質(zhì),同時(shí)能因缺

4、氧而滅菌或抑制某些細(xì)菌的活力;d 凍結(jié)時(shí)被干燥藥品可形成"骨架",干燥后能保持原形,形成多孔結(jié)構(gòu)而且顏色基本不變;e 復(fù)水性好,凍干藥品可迅速吸水還原成凍干前的狀態(tài);f 脫水徹底,適合長途運(yùn)輸和長期保存。雖然藥品冷凍干燥具有上述優(yōu)點(diǎn),但是干燥速率低、干燥時(shí)間長、干燥過程能耗高和干燥設(shè)備投資大等仍是該技術(shù)的突出缺點(diǎn)。3藥品凍干損傷和保護(hù)機(jī)理藥品冷凍干燥是一個(gè)多步驟過程,會(huì)產(chǎn)生多種應(yīng)力使藥品變性,如低溫應(yīng)力、凍結(jié)應(yīng)力和干燥應(yīng)力。其中凍結(jié)應(yīng)力又可分為枝狀冰晶的形成,離子濃度的增加,PH值的改變和相分離等情況。因此,為了保護(hù)藥品的活性,通常在藥品配方中添加活性物質(zhì)的保護(hù)劑。二、凍干

5、優(yōu)化1凍干保護(hù)液配方的優(yōu)化配方中的固體含量會(huì)影響凍結(jié)和干燥過程。如果固體含量少于2%,那么凍干藥品結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能就會(huì)不穩(wěn)定。尤其在干燥過程中,藥品微粒不能粘在基質(zhì)上,逸出的水蒸氣會(huì)把這些微粒帶到小瓶的塞子上,有時(shí)甚至?xí)У秸婵帐耶?dāng)中。此外,為了獲得均勻一致、表面光滑、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥品,配方中必須含有填充劑、賦形劑、穩(wěn)定劑等保護(hù)劑,這些保護(hù)劑對(duì)實(shí)現(xiàn)藥品的玻璃化凍結(jié)有重大的影響。很多糖類或多元醇經(jīng)常被用于溶液凍融和凍干過程中非特定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑,它們既是有效的低溫保護(hù)劑又是很好的凍干保護(hù)劑,它們對(duì)凍結(jié)的影響取決于種類和濃度。凍干制品的整個(gè)凍干過程存在著各種各樣的應(yīng)力,通常包括低溫應(yīng)力、凍結(jié)應(yīng)力(包

6、括枝狀冰晶的形成、離子強(qiáng)度的增加、PH值的改變、相分離等、干燥應(yīng)力(移去蛋白質(zhì)表面單層水分子等,這些應(yīng)力常常是直接或間接導(dǎo)致蛋白質(zhì)藥物不穩(wěn)定的因素。根據(jù)保護(hù)劑對(duì)抗應(yīng)力的不同可把蛋白質(zhì)保護(hù)劑初步分為冷凍保護(hù)劑和凍干保護(hù)劑。一個(gè)優(yōu)良的蛋白質(zhì)保護(hù)劑不僅能夠在整個(gè)凍干過程中對(duì)蛋白質(zhì)藥物起到良好的保護(hù)作用,而且能夠?qū)Τ善焚A藏期內(nèi)蛋白質(zhì)藥物的變性起到抑制作用,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)藥物在貯藏期的變性率往往比在整個(gè)凍干過程中的變性率要大。保護(hù)劑的分類a糖類:蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖等;糖是最常見、使用最廣的一類凍干保護(hù)劑,是蛋白質(zhì)的非特異性穩(wěn)定劑,在凍干的各個(gè)階段(如冷凍凍融及升華干燥等均能對(duì)蛋白質(zhì)藥

7、物起到一定的保護(hù)作用。糖的保護(hù)作用與其及蛋白質(zhì)的種類有關(guān)。而雙糖是研究最多也是公認(rèn)最有效的保護(hù)劑。糖對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用大小有時(shí)依賴于其濃度,通常在某個(gè)濃度范圍內(nèi)糖的保護(hù)作用隨著濃度的升高而增大,當(dāng)達(dá)到某一濃度時(shí)保護(hù)作用達(dá)到最大值而此后再增大糖的濃度則保護(hù)效果不再顯著增加有時(shí)反而會(huì)降低。蔗糖是由一分子葡萄糖及一分子果糖所構(gòu)成的雙糖化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,多呈無定型結(jié)構(gòu)。對(duì)阻止蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變,凍干處理過程中及貯藏期內(nèi)蛋白質(zhì)的伸展和聚集起顯著作用。海藻糖具有更高的玻璃化溫度更低的引濕性更不具有還原性。這些優(yōu)點(diǎn)均預(yù)示著海藻糖可能具有更廣闊的應(yīng)用前景。葡萄糖在凍干過程中可部分保持無定型,對(duì)某些蛋白質(zhì)藥物具有一

8、定的保護(hù)作用但應(yīng)該注意的是葡萄糖系還原性糖。在選其作為蛋白質(zhì)的保護(hù)劑時(shí)要慎重。b 聚合物:HES、PVP、PEG、葡聚糖、明膠、白蛋白等;通常聚合物的穩(wěn)定作用取決于聚合物的多重性質(zhì),如優(yōu)先從蛋白質(zhì)表面析出、表面活性、使蛋白質(zhì)溶液黏度升高從而阻止其他小分子(如糖及多羥基化合物的結(jié)晶、抑制冷凍過程中值的劇烈變化等。c 多羥基化合物:甘露醇、肌醇、聚乙二醇等;甘露醇不僅可作為優(yōu)良的骨架劑使用而且在一些處方中它能夠兼作蛋白質(zhì)的凍干保護(hù)劑。d 表面活性劑:Tween、曲拉通等;吐溫、布里杰普朗尼克及十二烷基磺酸鈉等一些表面活性劑有時(shí)對(duì)冷凍及干燥過程中的蛋白質(zhì)起到一定的保護(hù)作用。e 氨基酸:L-絲氨酸、谷

9、氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等;無定型甘氨酸可阻止凍干過程中,重組人生長激素的聚集結(jié)晶型甘氨酸能升高成品的塌陷溫度阻止因塌陷而引起的蛋白質(zhì)藥物的破壞。f 鹽和胺:磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽等;某些凍干制品中加入鹽和胺可獲得特定的蛋白質(zhì)穩(wěn)定化效果。g蛋白質(zhì):BSA、人血清蛋白蛋白質(zhì)藥物本身:一些蛋白質(zhì)經(jīng)凍融后的活性直接和蛋白質(zhì)的起始濃度有關(guān),起始濃度升高有時(shí)會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的復(fù)性。外來蛋白質(zhì)類保護(hù)劑:為血清白蛋白它是一個(gè)經(jīng)典優(yōu)良的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。保護(hù)劑的選擇如何獲得穩(wěn)定的蛋白質(zhì)凍干制品選擇適宜的保護(hù)劑至關(guān)重要,那么如何去選擇適宜的保護(hù)劑呢?首先要對(duì)被保護(hù)的蛋白質(zhì)藥物理化特性有一個(gè)充分的了解,繼而再通過

10、試驗(yàn),摸索出在凍干過程及貯藏過程中導(dǎo)致該蛋白質(zhì)藥物不穩(wěn)定的因素,然后針對(duì)這些不穩(wěn)定性因素選擇具體的保護(hù)劑。一般而言糖及多羥基化合物是最常用的凍干保護(hù)劑。其中蔗糖海藻糖等雙糖對(duì)一些蛋白質(zhì)均能顯示出良好的保護(hù)作用。故在選取凍干保護(hù)劑時(shí)應(yīng)給予優(yōu)先考慮,一個(gè)優(yōu)良的凍干保護(hù)劑應(yīng)該具備多種保護(hù)特性。如高的玻璃化溫度低的吸濕性能低的結(jié)晶速率及不具有還原性基團(tuán)等。 但任何單一的保護(hù)劑都不可能具備所有的保護(hù)特性,因此有時(shí)還得考慮使用兩種或兩種以上的保護(hù)劑來穩(wěn)定蛋白質(zhì)藥物 。在考慮合用保護(hù)劑時(shí),通常使用不同種類的保護(hù)劑能獲得顯著的保護(hù)效果,但是采用盡可能少的輔料種類對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有著重要意義。所以在選擇保護(hù)劑時(shí)要綜合

11、考慮多種因素盡量節(jié)約成本和減少工作量保護(hù)劑對(duì)某一蛋白質(zhì)的保護(hù)作用通常有一個(gè)最佳的使用濃度或使用量 。故選擇保護(hù)劑時(shí)還要合理選擇使用量。附:配方方案計(jì)劃方案緩沖液體系硼酸緩沖液Tris-HCL 體系磷酸鹽體系碳酸鹽體系糖類蔗糖海藻糖甘露醇氨基酸甘氨酸聚合物PEG PVP 蛋白質(zhì)BSA PH7.68.6鹽和胺多羥基化合物1.選取配方16種配方,分別凍乳膠標(biāo)記物和質(zhì)控品2計(jì)劃量乳膠每種180只質(zhì)控品高低各90只100ng/ml,10ng/ml 3觀察外觀(淘汰不合格配方a外形b復(fù)水性好, 藥品可形成"骨架",干燥后能保持原形,形成多孔結(jié)構(gòu)而且顏色基本不變凍干藥品可迅速吸水還原成凍

12、干前的狀態(tài)4功能性(淘汰不合格配方凍干前后對(duì)比(熒光值和效價(jià)均一性(10個(gè)平行樣線性乳膠標(biāo)記物:凍干前后熒光值對(duì)比。質(zhì)控品:凍干前后賦值對(duì)比2凍干曲線(希望至少3條凍干曲線一般情況下,凍干曲線的選擇是三個(gè)參數(shù):板層溫度/真空度/產(chǎn)品溫度.通常來說,凍干曲線的制定是一個(gè)固定模式:制訂凍干曲線應(yīng)該知道產(chǎn)品的一些數(shù)據(jù)和裝載情況,作為設(shè)定溫度,時(shí)間和真空的依據(jù),這些數(shù)據(jù)和情況是:產(chǎn)品的共晶點(diǎn)和崩解點(diǎn)溫度,產(chǎn)品冷凍時(shí)是否會(huì)形成玻璃態(tài),如果會(huì)形成玻璃態(tài),產(chǎn)品的回?zé)釡囟仁嵌嗌?產(chǎn)品的裝載厚度,產(chǎn)品的容器和裝載方法,產(chǎn)品的濃度,產(chǎn)品的最高許可溫度和干燥后的殘水含量等。例如假設(shè)某一產(chǎn)品的共晶點(diǎn)是-20,崩解點(diǎn)高

13、于共晶點(diǎn),產(chǎn)品冷凍時(shí)會(huì)形成玻璃態(tài),產(chǎn)品的回?zé)釡囟仁?18,產(chǎn)品的裝載厚度是12 毫米,小瓶裝載并直接放置在板層上,產(chǎn)品的濃度是15%,產(chǎn)品的最高許可溫度是30,干燥后殘余水分含量要求是2%。要制訂凍干工藝曲線。預(yù)凍階段:為了獲得產(chǎn)品一致的冷凍結(jié)構(gòu),產(chǎn)品在5進(jìn)箱,進(jìn)箱完畢后保持1 小時(shí),使所有產(chǎn)品從5的同一起點(diǎn)降溫到-40,并在-40并保持1 小時(shí),由于產(chǎn)品冷凍時(shí)形成玻璃態(tài),因此需做回?zé)崽幚?把產(chǎn)品加熱到-18并保持1 小時(shí),使產(chǎn)品從玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)晶態(tài),然后使產(chǎn)品再次降溫,并在-35保持1 小時(shí),預(yù)凍階段結(jié)束。升華階段:板層溫度控制在10,使產(chǎn)品的溫度維持在-25,比產(chǎn)品的共晶點(diǎn)溫度低5,并在此

14、狀況下維持15 小時(shí),直到產(chǎn)品中的凍結(jié)冰升華完畢為止;凍干箱的真空度控制在產(chǎn)品溫度所對(duì)應(yīng)的飽和蒸汽壓的30%左右,-25對(duì)應(yīng)的飽和蒸汽壓是0.63 毫巴,0.63×30%=0.189 毫巴。解吸階段:把產(chǎn)品溫度加熱到最高許可溫度30并維持到凍干結(jié)束,真空控制在產(chǎn)品溫度達(dá)到最高溫度后停止使用,恢復(fù)高真空,在最高許可溫度和高真空的狀況下保持6 小時(shí),使產(chǎn)品的殘余水分達(dá)到低于2%的要求。另外,凍干良好的產(chǎn)品應(yīng)有良好的物理形態(tài),外觀無缺損,表面平整,體積與凍結(jié)時(shí)的體積基本相等,顏色均勻一致,內(nèi)部疏松多孔,復(fù)水迅速而完全,殘余水分含量合格,效價(jià)高,能長期存放。如果按照某一凍干曲線凍出的產(chǎn)品全部合格,凍干時(shí)間也合適,那么該凍干曲線是成熟的曲線。如果干燥后的產(chǎn)品不理想,某些項(xiàng)目不合格,那么要對(duì)凍干曲線作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。5穩(wěn)定性4和37(2個(gè)月(兩個(gè)月基本可以淘汰穩(wěn)定性不好分別測(cè)4和37的檢測(cè)值每個(gè)星期一次。乳膠標(biāo)記物每個(gè)配方測(cè)高低值各5個(gè)平行樣。(所以每次每個(gè)配方需要20只凍干品質(zhì)控品每個(gè)配方測(cè)高低值各5個(gè)平行樣(所以每次每個(gè)配方高低值各需要10只凍干品6連續(xù)穩(wěn)定性在合格的配方中再次凍干,