腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因工程細(xì)胞腦內(nèi)移植治療帕金森病大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

1、    腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因工程細(xì)胞腦內(nèi) 移植治療帕金森病大鼠的實(shí)驗(yàn)研究        【摘要】目的觀察腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）基因工程成肌細(xì)胞腦內(nèi)紋狀體移植對(duì)帕金森病大鼠的治療作用。方法建立逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的BDNF表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞，篩選陽性細(xì)胞進(jìn)行腦內(nèi)移植。結(jié)果基因工程成肌細(xì)胞腦內(nèi)移植可明顯提高帕金森病大鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）陽性神經(jīng)元的存活率，使紋狀體多巴胺含量明顯增加，動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)行為改善約50%，并持續(xù)2個(gè)月之久。結(jié)論腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因工

2、程成肌細(xì)胞腦內(nèi)紋狀體移植可明顯改善動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)行為并可促進(jìn)黑質(zhì)神經(jīng)原的存活，為帕金森病的治療提供了一種新的有效的治療方法?！娟P(guān)鍵詞】帕金森病腦源性神經(jīng)生長因子基因療法Grafting myoblasts genetically engineered to produce BDNF in rats Parkinson disease modelsQU Shen, HE Xiaolong, HE Cheng, et al. Department of Neurobiology, The Second Military Medical University, Shanghai 200433.【Abst

3、ract】ObjectiveTo observe the role of genetically engineered myoblast in the treatment of rat Parkinson disease models. Methods Genetically modified myoblasts to produce brain derived neurotrophic factors (BDNF) were established and grafted into the corpora striata of Parkinson disease modelsin rats.

4、 The behavior and pathological changes were observed and the Dopamine contents in the corbora striata were measured with high performance liquid chromatography (HPLC). ResultsThe intracranial graft of genetically engineered myoblasts can promote the survival of TH-positive neurons in the nigra of Pa

5、rkinson's rat and the content of Dopamine in the striatum were increased significantly. The rotation behavior improved 50% after the transplantation. Conclusion It is suggested that BDNF secreting myoblasts can promote the survival of the neuron and provide a new and effective method for the tre

6、atment of Parkinson disease. 【Key words】Brain-derived neurotrophic factor Parkinson disease Gene therapy 帕金森病(PD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴(yán)重影響到患者的健康和生存能力，主要表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的喪失，紋狀體多巴胺含量嚴(yán)重下降，臨床上以震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩為主要表現(xiàn)。至今尚無有效的藥物能阻止神經(jīng)元的變性，使病情逆轉(zhuǎn)。腦源性神經(jīng)生長因子能特異性的促進(jìn)腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的存活，保護(hù)神經(jīng)元免受神經(jīng)毒性的作用，為帕金森病的治療帶來了希望。血腦屏障的存在使常規(guī)的給藥方式受到了限制，而帕金

7、森病緩慢進(jìn)展的病情又需要反復(fù)長期給藥，基因治療的出現(xiàn)為此提供了可能，本研究擬通過腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因工程細(xì)胞腦內(nèi)移植在腦內(nèi)緩慢釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，在帕金森病大鼠中起到治療作用。 材料和方法一、BDNF基因工程細(xì)胞的構(gòu)建與篩選將EcoR1酶切下的BDNFcDNA經(jīng)酶切，補(bǔ)平，去磷酸化，平端連接于雙拷貝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PN2A，電泳，酶切鑒定為正向連接，電穿孔法轉(zhuǎn)染PA317包裝細(xì)胞，根據(jù)其攜帶的neo基因采用G418篩選轉(zhuǎn)染陽性克隆，選取高滴度的病毒上清感染成肌細(xì)胞L-6TG，G418 400 g/ml約2周后篩選出陽性細(xì)胞株，命名為BDNF（+）/L-6TG細(xì)胞。二、BDNF（+）/

8、L-6TG細(xì)胞BDNFmRNA的表達(dá)及生物學(xué)活性測(cè)定采用地高辛標(biāo)記BDNF探針Northern雜交證實(shí)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)有BDNFmRNA的表達(dá)，且基因工程細(xì)胞分泌上清能促進(jìn)PC12突起生長和細(xì)胞存活，證實(shí)其具BDNF的體外生物學(xué)活性。三、6-羥基多巴胺(6-OHDA)毀損制備PD大鼠模型參照Ungerstedt1等方法，雄性SD大鼠200220 g，2%戊巴比妥鈉麻醉后黑質(zhì)致密區(qū)定位注射（前囟后5.0 mm,旁開2.0 mm,硬膜下7.5 mm），微量注射器緩慢注入6-OHDA，每只4 l（2 g/l），3天后阿樸嗎啡腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，選取>10轉(zhuǎn)/分鐘的大鼠為PD模型成功大鼠，

9、120只大鼠中共制備得32只PD模型，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各13只，PD組6只，分別于1周后行細(xì)胞移植。四、基因工程細(xì)胞腦內(nèi)移植培養(yǎng)幾近融合細(xì)胞，胰酶消化后懸浮于磷酸緩沖液(PBS)中，細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行紋狀體移植（前囟前1.0 mm,旁開2.5 mm,硬膜下4.5 mm），每只4 l，細(xì)胞濃度104/l，對(duì)照組為L-6TG細(xì)胞腦內(nèi)移植。五、療效觀察1.行為學(xué)觀察：細(xì)胞移植后2、4、8周進(jìn)行阿樸嗎啡誘導(dǎo)，觀察動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)行為。2.形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)各期動(dòng)物進(jìn)行腦內(nèi)灌注，多聚甲醛固定，冰凍切片，片厚15 m，每個(gè)標(biāo)本同一平面順切4張切片進(jìn)行黑質(zhì)尼氏染色和TH免疫組化染色，用中科院通用顆粒分析系統(tǒng)軟件對(duì)尼氏染色和

10、酪氨酸染色陽性神經(jīng)原進(jìn)行計(jì)數(shù)和面積測(cè)定。3.腦內(nèi)紋狀體多巴胺含量測(cè)定：不同階段實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭取腦，冰上分離紋狀體，置-70冰箱待測(cè)。測(cè)定時(shí)稱重勻漿，應(yīng)用高壓液相電化學(xué)檢測(cè)器進(jìn)行多巴胺含量測(cè)定。色譜條件：色譜柱25.0 cm、4.6 mm,顆粒度5。流動(dòng)相：NaH2PO42H2O,辛烷磺酸鈉，EDTA2Na，乙晴。用0.2 m纖維素脂膜過濾，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85的磷酸調(diào)pH至3.5，流速1.0 ml/min，電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)電壓0.65 V，參比電極Ag/AgCl,靈敏度3 2Nf/mV，進(jìn)樣100l。標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，作稀釋曲線。六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計(jì)方法為小樣本均

11、數(shù)t檢驗(yàn)和多樣本均數(shù)方差分析。結(jié)果一、行為學(xué)觀察阿樸嗎啡誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為測(cè)定顯示基因工程細(xì)胞移植組大鼠的旋轉(zhuǎn)行為在細(xì)胞移植2周后減少50%，且可持續(xù)2個(gè)月之久，而PD組和與成肌細(xì)胞移植對(duì)照組旋轉(zhuǎn)行為無明顯改變，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理相差非常顯著。二、形態(tài)學(xué)觀察1.尼氏染色：黑質(zhì)尼氏染色顯示毀損側(cè)神經(jīng)元較之健側(cè)在各期均明顯減少，三組毀損側(cè)相比，神經(jīng)元存活數(shù)和存活率基因工程細(xì)胞移植組與對(duì)照組和帕金森組比較均明顯提高，細(xì)胞數(shù)在2周后分別為453.3±65.2、365.5±95.6和288.3±44.0,存活率分別為(68.8±10.1)%、(47.2±4.1)

12、%和(52.5±3.7)%,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組及PD組均相差顯著。2.TH免疫組化：黑質(zhì)TH免疫組化顯示，三組中毀損側(cè)TH陽性神經(jīng)元存活較之健側(cè)在各時(shí)程均有差異，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和PD組在細(xì)胞移植2周后的細(xì)胞數(shù)分別為80.5±23.8，37.5±16.7和32.5±19.7,與健側(cè)相比的存活率分別為(50.7±11.4)%、(29.7±5.9)%和(20.7±7.7)%?；蚬こ碳?xì)胞移植組毀損側(cè)神經(jīng)元存活數(shù)和存活率較之對(duì)照組和帕金森組均明顯提高，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理相差極為顯著。3.細(xì)胞移植后各期紋狀體多巴胺含量：高效液相測(cè)定

13、顯示各組毀損側(cè)紋狀體多巴胺含量較之健側(cè)均明顯降低，移植組毀損側(cè)多巴胺含量與對(duì)照組相比在各期均有明顯升高，移植組毀損側(cè)多巴胺含量為健側(cè)的51.0%，而對(duì)照組毀損側(cè)的多巴胺含量僅為健側(cè)的17.0%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理相差非常顯著(P<0.01)。討論帕金森病基因治療的研究目前主要集中在兩個(gè)方面：一個(gè)是以補(bǔ)充多巴胺的不足為目的，即先前的多巴胺和酪氨酸羥化酶（TH）的轉(zhuǎn)基因治療，TH是多巴胺合成中的限速酶，與腦內(nèi)多巴胺含量有明顯關(guān)系。國外Wolff等2和國內(nèi)趙迎春等3進(jìn)行了TH基因工程細(xì)胞大鼠紋狀體腦內(nèi)移植的研究，發(fā)現(xiàn)可改善動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)行為，TH陽性細(xì)胞存活增加，并可持續(xù)表達(dá)至數(shù)月之久。這些結(jié)果都表明T

14、H基因腦內(nèi)移植對(duì)帕金森病有治療作用。另一種方法是以挽救幸存神經(jīng)原為目的的基因治療，即神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因治療研究。近年來，BDNF對(duì)多巴胺神經(jīng)元的特異性作用引起了人們的關(guān)注，其體內(nèi)外作用已得到了深入的研究4，5，體內(nèi)BDNF對(duì)多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用已有大量證據(jù)，而其治療作用卻鮮有報(bào)道。David等6將BDNF基因工程成纖維細(xì)胞提前移植于1-甲基-4-苯-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)毀損的帕金森大鼠紋狀體，可防治1-甲基-4-苯基吡啶(MPP)對(duì)大鼠的毒性作用，黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞較之對(duì)照組明顯增加，說明其具有保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的作用，這可能是通過逆軸突轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制或增加線粒體的

15、功能發(fā)揮作用。本研究選擇了6-OHDA特異性毀損黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元制備帕金森癥動(dòng)物模型來研究BDNF對(duì)帕金森癥的治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在給予細(xì)胞移植后，動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)行為明顯減少并持續(xù)了2個(gè)月之久，與對(duì)照組相比，相差非常顯著，個(gè)別動(dòng)物旋轉(zhuǎn)行為完全消失。毀損側(cè)紋狀體多巴胺含量與對(duì)照組相比亦有明顯升高，分別為50%與16%，與David等研究相吻合。同時(shí)我們對(duì)不同治療階段鼠腦冰凍切片，進(jìn)行尼氏染色和TH免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)毀損側(cè)黑質(zhì)尼氏染色和酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元與對(duì)側(cè)相比均顯著減少，移植組細(xì)胞存活數(shù)和存活率與對(duì)照組、PD組相比均明顯增加，在各期均相差非常顯著。這些研究結(jié)果顯示，BDNF基因工程成肌細(xì)胞腦

16、內(nèi)移植可明顯促進(jìn)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的存活，阻止紋狀體多巴胺含量的降低，改善動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)行為，對(duì)帕金森病的治療有一定效果。目前認(rèn)為，帕金森病的治療從根本上解決問題應(yīng)當(dāng)是阻止和減緩神經(jīng)元的變性和死亡，先期采用的左旋多巴和TH的治療主要為一種補(bǔ)償性治療，不能從根本上挽救神經(jīng)元的變性和死亡，需長期表達(dá)和分泌維持治療效果，而BDNF可以阻止和減輕神經(jīng)元的變性和喪失，延緩緩慢進(jìn)展的帕金森病程，因此，不失為一有效的治療方法，如TH和BDNF聯(lián)合應(yīng)用則更有效和理想7。國外采用神經(jīng)生長因子和嗜鉻細(xì)胞的共同移植已取得了一定效果8。作者單位：200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)生物教研室(曲伸系研究生，現(xiàn)在

17、長海醫(yī)院內(nèi)分泌科)參考文獻(xiàn)1Ungerstedt U.Postsynaptic super sensitivity after 6-Hydroxydopamine induced degeneration of the nigro-striatal copamine system. Acta Phys， 1971，367(Suppl):69-90.2Wolff JA, Fisher LJ, Xu Li， et al. Crafting fibroblasts genetically modified to produce L-dopa in a model of Parkinson disea

18、se. Proc Natl Acad. Sci USA， 1989，86:9011-9014.3趙迎春，陳生弟，劉振國,等.酪氨酸羥化酶基因工程細(xì)胞植入大鼠紋狀體的研究. 中華醫(yī)學(xué)雜志，1996；76：52-53.4Wiegand S, Alexander C, Lindsay R, et al. Axonal transport of 125I-labeled neurotrophins in the central nervous system. Soc Neurosci Abstr, 1991,17:1121-1125.5Matin M,Todd K, Altar C, et al.Behavioral and in vivo neurochemical effects of the neurotrophic factors BDNF and NT-3 and their interaction with amphetamine. J Neurosci, 1994,14:12